Способ непрерывного культивирования светящихся бактерий рнотовастеriuм рноsрноrеuм
(72) Авторы изобретения
В.В. Заворуев и В.В. Иежевикин (71) Заявитель
Институт физики им. Л. В. Киренского (54) СПОСОБ НЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
СВЕТЯЩИХСЯ. БАКТЕРИЙ РНОТОВАСТЕВ!ОИ РНОЯРНОКЕоИ
Изобретение относится к микробио- логии и может быть использовано для тестирования ряда биологически активных веществ. Постоянное свечение получаемого урожая бактерий позволяет создать биолюминесцентный датчик непрерывного действия. Использование бактерий с постоянным уровнем люминес ценции удобно и при обычном применении светящихся бактерий для тестиро.вания загрязнения окружающей среды, ядов и наркотиков в медицине и т.д.
0Но может быть использовано и в,мик робиологической промышленности для непрерывного получения биомассы бактерий с высокой производительностью и большим содержанием люциферазы .
Высокое содержание люциферазы упрощает методику очистки этого фермента. Может быть использовано в научных исследованиях при изучении свя" зи между люминесценцией и процессами метаболизма в бактериях.
Известен способ непрерывного культивирования светящихся бактерий
Photobacterium be1arerskii в турби1 достате, где поддерживается на постоянном уровне оптическая плотность суспензии
Однако в процессе культивирования биолюминисценция изменяется на два порядка, т.е. активность люциферазы в клетке варьируют в 100 раз. Исполь зование такой биомассы для тестирования биологически активных веществ крайне затруднительно, а биомасса непригодна для получения. очищенных препаратов люциферазы.
33
Известен также способ культивирования Ph phosphoreum (СМВ 844), где подачей питательной среды и выводом готового продукта на постоянном уровне поддерживают совмещенный сигнал, который складывается из проходящего через культуру света от излучателя (оптическая плотность) и биолюминесценции бактерий. Соотношение
3 9278 между интенсивностью прошедшего через культуру света и интенсивностью биолюминесценции выбирают приблизительно равным 1:1. Питательная среда, применяемая для культивирования в момент ее добавления в культуру светящихся бактерий, должна ингибировать биолюминесценцию. Для этого используют сложную питательную среду
Oxoid Nutrient Broth (СИ1), к кото- io рой добавляют глицерина 1ь об./об. и 2,5i вес./об. NaC1 (21.
Недостатком этого способа является низкая стабильность биолюминес. ценции, которая составляет + 83. Био- is масса получаемая при этом более удовлетворительна для получения люци. феразы, но не пригодна для использования ее в качестве биолюминесцентного датчика непрерывного действия, когда требуется фиксировать изменение свечения меньше + 83. Кроме того, способ требует применения сложной аппаратуры управления процессом куль тивирования. 2S
Цель изобретения — повышение. стабильности биолюминесценции бактерий.
Поставленная цель достигается тем, что питательную среду добавляют, когда биолюминесценция превышает заданный уровень, причем питательная среда содержит хлористый натрий фосфорнокислый натрий двузамещенный, фосфорнокислый калий однозамещенный, фосфорнокислый аммоний двузамещенный, сернокислый магний, пептон и глицерин, при следующем соотношении компонентов, г/л:
28-30
Хлористый натрий фосфорнокислый натрий двузамещенный
Фосфорнокислый калий однозамещенный
Фосфорнокислый аммоний двузамещенный
Сернокислый магний
Глицерин
Пелтон
Вода
28-3o
8, 0-10
1,0-1,1
0,50-0,55
0,08-0,12
1,0-2 5
5,0 5 ° 1
NaCR
Ма НРО, -12Н О
КН ГО+ (NH 4)yHPO4. п980ф 7Н О
Глицерин
Пептон
8-10
1,0-1,1
Эта среда заливается в термостатируемый при 20 + О,! С культиватор
S0 емкостью 150 мл. После инокуляции бактерий исходная концентрация клеток
0,50-0,55
0,08-0,12
1-.2, 5
5,0 5
До 1000 мл
На чертеже изображено устройство, применяемое для реализации предлагаемого способа.
Устройство состоит из термостатируемого культиватора 1, датчика био„
53 люминесценции бактерий 2, самописца с позиционным регулятором 3, насосадозатора, подающего питательную среду в культиватор 4, резервуара с пи. тательной средой 5 и сборника урожая 6.
Тврмостатируемый при температуре оптимальной для роста и люминесценФ ции бактерий культиватор заполняется питательной средой ° Туда же вводится инокулят бактерий ° Культивирование ведут при интенсивном перемешивании и барботаже. Интенсивность биолюминесценции и количество клеток увеличивается. После достижения заданного уровня люминесценции с Ilo мощью позиционного регулятора включается насос-дозатор, подающий питательную среду в культиватор. Одновременно эквивалентный объем культуральной жидкости со светящимися бактериями сливается в сборник урожая. После разбавления культуры и уменьшения интенсивности биолюминесценции, контакты позиционного регулятора возвращаются в исходное положение и подача питательной среды прекращается. Затем процесс повторяется. Интенсивность люминесценции записывается непрерывно с помощью самописца. Скорость подачи питательной среды насосом-дозатором выбирается так, чтобы проток (отношение объема среды, прокаченного насосом за определенный промежуток времени к объему культиватора) был больше максимальной скорости роста бактерий.
Пример . Готовят 2 л среды, содержащей, г/л: O,65 ° 10" кл/мл, а интенсивность биолюминесценции 2,5 отн.ед. Барботаж осуществляют из расчета, чтобы количество подаваемого в 1 мин воздуха было равно объему культиватора, т.е.
150 мл/мин, после достижения заданного уровня, равного 40 отн. ед., замыкает. ся .позиционный регулятор и включается
927853
28-30
8-10
1,0-1,1
0 50 0э55
0,08-0,12
1,0 2 5
5,0-5,1
До l000 мл
Формула изобретения насос-дозатор подачи питательной среды, обеспечивающий скорость протока 1,5 ч-". Максимальная удельная скорость роста Ph. phosphoreum sa данной среде равна 0,4 ч ". После установления стационарного режима удельная скорость роста бактерий
0,3-0,35 ч, а число клеток 0,4
„1О-а „ /
Использование предлагаемого способа культивирования позволяет стабилизировать биолюминесценцию Ph, phosphoreum с точностью + 0,63. При этом не требуется сложная аппаратура. Вся установка собрана иэ широко распространенных приборов и узлов. Производительность предлагаемого способа культивирования в 2,5 раза выше, чем в периодическом режиме.
Способ непрерывного культивирования светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum на питательной среде, содержащей источник углерода и минеральные соли, о т л и ч à o— шийся тем, что, с целью повышения стабильности биолюминесценции, питательную среду добавляют, когда биолюминесценция превышает заданный уровень, причем питательная среда содержит хлористый натрий, фосфорнокислый натрий двузамещенный, фосфорнокислый калий однозамещенный, фосфорнокислый аммоний двуэамещенный, сернокислый магний, пептон и гли.
$ церин при следующем соотношении компонентов, г/л:
Хлористыи натрии фосфорнокислый натрий двузамещенный фосфорнокислый калий одноэамещенный фосфорнокислый аммоний двузамещенный
Сернокислый магний
Глицерин
Пептон
Вода
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
l. Фиш А.М. Исследование неко-орых сторон метаболизма светящихся бактерий в непрерывной культуре. Автореф.канд. диссертации, Красноярск, зо 1969.
2. Mardley-Smith В. et al l. The
cont inous culture of luminous Ьасteria. 3. Аррl. Bact., 1975, 39, р.337-343 (прототип) .
ВНИИПИ Заказ 3170/36
Тираж 505 Подписное
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
