Способ получения иммобилизованного осахаривающего ферментного препарата

 

Cps Советсюа

Сонмалнстицеора

Республин (((9214 70

Рь ПАУЕКТУ (61) Дополнительный к патенту

1 (223 3+<8>e o 01.07.77 (21) 2503856/23-04

1 (23) Приоритет — (32) 02.07.76 (51) М. Кл.

С 12 и 1100

С 12 N 9/24

С13К 106

Р улаРатаиныя "анятвт

COCA ю явлен имбрвтеяяй и впрьпий (31) 27749/76 (33) Великобрип»иия

Опубликовано 15.04,82. бюллетень «М» 14 () УДК 577.15. .07 (088.8) Дата опубликования описания 15.04.82 (д..) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО

ОСАХАРИВАВЩЕГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА

Изобретение относится к способам получе- ния нерастворимых ферментных препаратов, . в частности: препаратов, полученных на основе осахаривающих ферментов — амнлоглюкозадазы и а-амилазы, которые находят применение в- . пищевой и смежных с ней отраслях.

Процесс превращения в нерастворимое состояние (или иммобилизация) внеклеточных и внутриклеточных растворимых в воде, ферментов, т. е. фиксация каталически активных (на. тинных) ферментов в твердых или квазитаер. дых, формованных или обладающих способ. постыл формоваться структурах, становится все более важным в технологическом, а также в экономическом отношении, поскольку он. может рассматриваться как средство, позволяющее повторно использовать измельченный фермент в процессах периодического действия: или применять его в непрерывном цроцессе в так называемых энзимных реакторах.

В течение последних лет значительные yo»i лия были направлены на развитие технологии иммобилизации в промышленности. по производству крахмала, что связано с производством таких продуктов, как высококонцентрированные сиропы декстрозы и фруктозы.

Недавно в пищевой и родственных ей отраслях промышленности возросла относительная зна5 чимость второго иэ укаэанных двух продуктов, причем высоко концентрированные сиропы фруктозы преимущественно вытесняют сироп сахарозы,и менее сладкий высококонцентрированный сироп декстрозы. Ила дополнитель»и ных типа сахарного сиропа, полученных гидро. лизом крахмала и содержащих значительное количество мальтозы (т.е. сиропы с высоким содержанием мальтозы и высокой степенью конверсии) используются во все возрастающей а степени особенно в кондитерской (твердые: леденцы) и консервной промышленности.

Полный промьппленный процесс превращения крахмала через стадию образования сиропа с высоким содержанием декстрозы в сироп ец с высоким содержанием фруктозы включает

I три последовательные стадии, а именно процесс разбавления или разжижения крахмала в. декстрины, катализируемый кислотой (или бактериальной а-амилазой, йоследуюшего 921470

I осахаривания их до сиропа с высоким содержанием декстрозы и превращения последнего в сироп с высоким содержанием фруктозы, причем каждый процесс катализируют специфическим для него ферментом, а именно амилоглюкозидазой и глюкозоизомераэой соответственно. В то время, как в результате ряда . недавно проведенных технологических разработок стало возможным и первую, и третью стадии указанной последовательности осущест- 1О влять непрерывно, промышленное осахаривание (т, е. вторая стадия) преимущественно еще остается процессом периодического действия.

Сироп с высоким содержанйем мальтоэы также можно получить из крахмала.

Осахаривание разжиженного крахмала, в результате которого получают сироп с высоким содержанием мальтозы (и обычно содержащий относительно небольшое количество глюкозы), осуществляют с помощью маль1огенной амилазы, предпочтительно грибковой а-амилазы.

Подобно гликогенному осахариванию соответствующий мальтогенный процесс обычно осуществляют как периодический процесс с использованием растворимого фермента.

Хотя предпочтительность полностью непрерывного процесса очевидна, совершенствование конструкций промышленного ферментативного реактора, основанных на использовании на стадии осахаривания иммобилизованной амилоглюкозидазы, находится на начальной стадии, Известно несколько способов иммобилизации осахариваюших ферментов, например, амилоглюкозидазы, связыванием фермента с нерастворимым органическим или неорганическим носителем. Однако только немногие из этих способов вышли за пределы лабораторной практики.

Известен, например, способ получения иммобилизованного осахаривающего ферментного препарата на основе амилоглюкозидазы путем ковалентного связывания ее с пористыми частицами стеклянных или керамических материалов с помощью глутарового альдегида. Частицы носитео ля со средним диаметром пор около 400 А помещают в олонку и последовательно пропускают через нее раствор глутарового альдегида и раствор фермента. Получаемый продукт используется в непрерывном процессе осахаривания. Колонку опытной заводской установки заполняют полученным измельченным прераратом фермента и заливают растворами выпускаемых промышленностью декстринов. Достигается степень превращения в декстрозу, которая приближается к 92%, что обычйо реализуется в процессах периодического осахаривания 55 с растворимой амилоглюкозидаэой.

Однако в отличие от периодического процесса, в котором используется свободный энзим, в случае процесса в колонке степень вазимопревращений, т. е. повторной полимериэации глюкозы в мальтозу, изомальтозу и более высокие олигомеры, катализируемой амилоглюкозидазой, довольно высока (10%). Повышенное взаимопреврашение, с которым сталкиваI ются при использовании иммобилизованного энзимного препарата этого типа, по-видимому частично обусловлено применением пористых энзимных носителей, Очевидно пористая структура в очень значительной степени увеличивает общую площадь поверхности, обусловливая максимальное связыванне энзимов, и, следовательно, максимальную ферментативную активность получаемого иммобилизованного ферментного препарата 11) .

Однако сочетание высокой концентрации фермента, связанного с поверхностью пор носителя, и пониженной скорости диффузии в пределах пор неизбежно приводит к локально высоким концентрациям глюкозы, что создает благоприятные условия для ускорения ферментативных процессов с высокими Кмзначениями (т. е. нежелательных реакций взаимопревращений, особенно тех, которые приводят к образованию изомальтозы и изомальтриозы) .

Целью. изобретения является улучшение качества получаемого иммобилизованного ферментного препарата, обуславливаюшее снижение образования продуктов побочной полимеризации при использовании полученного препарата в процессе осахаривания, При этом рабочие характеристики получаемого препарата должны быть существенно приближены к характеристикамь растворимого фермента независимо от того, используется ли иммобилизованный препарат в процессе периодического действия или в процессе с непрерывной схемой.

В случае иммобилизованного препарата амилоглюкозидазы это требование ведет к тому, что непрерывный процесс осахаривания может осуществляться при таких особо предпочтительных условиях (например при таком составе и скорости подачи декстрина), нри которых концентрация глюкозы на выходе равна 92%, причем суммарная концентрация дисахаридов (мальтозы и изомальтозы) и трисахаридов (в основном панозы и изомальтотриозы) не превосходила бы примерно 4 и

1% соответственно.

В случае иммобилизованной мальтогенной а -амилазы необходимыми параметрами конверсии являются следующие: мальтоза примерно

40 — 60%; мапьтотриоза 25 — 35% и глюкоза менее 10%.

Указанная цель лостигается тем, что согласно способу получения иммобилизованного

5 921470 6 осахаривающего ферментного препарата путем; Кроме того, степень набухания в воде должна связывания фермента с нерастворимым носи- быть разумно низкой, предпочтительно не телем с помощью глутарового альдегида в ка- должна превышать 200%. Примером продукта, честве носителя используют гранулированный который удовлетворяет указанным требованиям, казеин, процесс связывания осущетсвляют при 5 может служить гранулированный каэеин, осаж:перемешивании в водной среде при дополни-. денный кислотой. Пищевые сорта продуктов тельном присутствии яичного альбумина при этого типа, предпочтительно имеющие размер следующих соотношениях компонентов: частиц 100 — 500 мкм, могут;быть.: получены фермент:носитель (0,02-0,2):1; фермент:альбу- из различных источников, например они вымии (0,2-1 5):1; глутаровьп альдегид:фер- 1î пускаются французской Компанией Сцерма С. А. мент с апьбумином (02;0 4):1 и содержании Сканированием в электронном микроскопе уставоды в реакционной смеси 30 — 60 вес.% с . новлено,,что поверхность таких частиц имеет последующими механическим, дроблением полу- очень изогнутую и нерпавильную форму, Hasoченного продукта и сушкой. минающую макроскопический вид пемзы. Веро

В качестве осахаривающего фермента ис I 5 ятно такая похверностная мнкроструктура об:пользуют амилоглюкозидазу или (ь у падает большим числом связующих участков

Глуировый альде д об о используют д"" "УтаРового а"декад в виде 50 o-ного .водного раствора. Для осуществления изобретения важным обстоятельством является то, что альбумнн, составляет 100 — 500 мкм. применяемый в качестве связующего белка, ю sp ay s р ески м нове о рас оряетс в воде. предпочтительдым сортом аль бумнна лированный казеин покрытые белковым слоем альбумина, проницаемым для жидкости, и в продукт. этом слое осахаривающий фермент поперечно сшит с альбумнном яйца. умнно яйца. с помощью глутароопределенная степень агломерации покрытых вого альдегида. частиц, что приводит к завершению реакции

Способ осуществляется следующим обрапоперечного сшивания прн образовании влажзом. ного, крупногранулированного и кускового

Тщате но пере е вае ю сухую смесь зо пРодУкта. Этот пРодУкт должен быть подвеРггр лированного казе на и порошка ал буми- нУт дальнейшем измельчению, напРимеР, путем гранулирования с образованием измельщей о харив и фермент и глутафовый ченного продукта с размером частиц в преде nрн pЯ 4 7 пpwaM почти ельном назоне. Р 3лиРование може.

ыьбу.,н может быть произвольно растворен 35 -УществплтьсЯ " колеблющемсЯ гРаУЛЯтос этими компонентами вместо смешения его ре типа, который-поставляется рядом Компав сухом состоянии с казенном, выдерживают ний (фирма Диаф, Копенгаген, или фирма полученную смесь в спокойном состоянии, Маности, Ливерпуль). Гранулированный прокак правило, при те е„окру ющей дукт пРопУскают чеРез сита, напрнмеР с Разсреды, чтобы завершить покрытие носителя 4О мером отверстий 1-2 мм, и он может быть осбелковым слоем и процесс сшивания попереч- вобожден от тонкого матеРиала стандаРтными ными связями белка. Смешение может осущест- способами.,Полученный продукт может быть вляться или вруую например путем щат ПРомыт и затем вы Ушен до тРебУемого деР-ного перемешивания и измельчения в ступе, путем тщательного перемешивания и измель 45 Перед применением в процессе .осахаривания чения в ступе, илн механически, например в высушенный ферментный продукт обычно горизонтальной мешалке отвального типа, пос- улучшают, для чего предварительно вымачивают .1. ГЮ / тавляемои формои Людиге Машиненбау, Запад- его в водном растворе. На этой стаднн,,а также ная Германия, нли в аналогичного типа выпус- на начальной стадии последующего использовакаемых промышленностью мешалках. SO ния может происходить определенное уменьшеСодержание воды в смеси должно составлять ние активности фермента. Найдено, что включе30 — 60 вес.%. ние дополнительной стадии поперечной сшивки ., Важное значение имеют свойства гранулиро- произвольно в сочетании с процессом намачива- ванного казеинового продукта, используемого иия может привести к значительному снижению в качестве материала носителя. Так, гранулы . Указанной потери активности фермента. Отсюда, казеина должны обладать значительной физичес- в соответствии с предпочтительным вариантом кой прочностью, чтобы обладать способностью воплощения изобретения, осуществляют предва1 противостоять значительным деформациям, воз- рительную обработку ферментативного препараникающим при намачнваннн насадки. колонки, та водным раствором, содержащим приемлемое сутствии 4,3 ммолей Са -ионов, определяют Ф удельную активность растворимой а-амилазы, а также удельную активность иммобилизованного фермента, выражаемые как количество фермента или ферментативного продукта, которое гидролиэует водный раствор, содержащий растворимый крахмал (марки Мерк Амилум солюбиле, ДАВ, Erg. 8. Vt), (695 г на

1000 мл) с начальной скоростью 5,26 мг крахмала в час. Для контроля за реакцией следят за образованием голубой окраски с йодом. При разрушении эмульсии крахмала эта окраска становится слабее и постепенно превращается в красновато-коричневую. Изменение цвета контролируют визуально сравнением с окрашенными стеклянными стандартами.

Активность иммобилиэованного фермента проверяют при условиях, аналогичных тем, которые указаны щя амилоглюкоэидазы.„

В качестве растворимых осахаривающих ферментов используются выпускаемые промышленностью амилоглюкозидаза Ново 150 и Фунгамил 1600 (Фунгамил- — патентованное . торговое название продукта), Первый, который продается в виде водного раствора, обычно превращают в высушенный в струе порошок перед его использованием. Процессу сушки может предшествовать ультрафильтрование, обычно объединяемое с процедурой промывки для удаления низкомолекулярных примесей.

При применении процессов концентрирования данной области, легко может быть получен твердый амилоглюкоэидазный продукт с активностью 5000 ед. на грамм или более высокой активностью.

Фунгамил 1600, поступающий в продажу в . виде порошка, имеет активность 1600 ед. на грамм.

Может быть использован как непосредственно коммерческий препарат, так и препарат,. подвергнутый дополнительному концентрированию и очистке.

Полное извлечение активности в иммобилизованном осахаривающем ферментативном -продукте зависит от конкретных параметров процесса иммобилизации, но составляет обычно не менее 40%.

Субстратом в процессе осахаривания,, осуществляемом с помощью иммобилизованного ферментативного препарата в соответствии с изобретением, может служить любой олигосахарид, претерпевающий осахаривание в присутствии соответствующего растворимого фермента. Примерами предпочтительных субстратов могут служить декстрины, получаемые кислотным и/или ферментативным разжижением крахмала и характеризуемые lIE-величинами, равными

5 — 40; высококонцентрированные сиропы маль*

7, 92И70 8 количество глутарового альдегида, предпочтительно от 0,5 до 5%, с последующим, как правило, удалением избытка реагента путем промывки и извлечением высушенного препарата. . Дополнительно установлено, что при предварительной обработке ферментативного продукта солью сернистой кислоты может достигаться значительное увеличение степени превращения (выраженной в процентах декстрозного эквивалента или величиной 3E) осахаренного продук-ф та. Сульфитное действие весьма вероятно связано с "раскрытием" определенных сетчатых

Ф структур, включающих белковый ферментативно-активный слой, но, по-видимому, без связывания энзима, что тем самым облегчает доступ более высокомолекулярных олитосахаридов к активным участкам фермента.

Таким образом, предпочтительна обработка ферментативного продукта разбавленным водным раствором сульфита, содержащим 0,1—

2% сульфита натрия при РН 4 — 5. Сульфитную обработку предпочтительно проводят при комнатной температуре и обычно прерывают через

120 мин промывкой водой с последующим извлечением высушенного продукта. Установлено, что после обработки сульфитом не происходит потери активности(фермента.

Ферментные препараты, приготовленные в соответствии с описанной процедурой, могут использоваться в процессе осахаривания либо периодического действия, включающем отделение и повторное использование ферментативно- " " очистки, хоРошо известных специалистам, в

ro препарата, либо непрерывного действия в ферментативном реакторе, Амилоглюкозидазу получают культивирова35 нием штаммов, принадлежащих к виду Aspergi11us или Rizopus, т. е. Aspergi11us niger или

Rizopus de1etnar. Мальтогенную и -амилазу предпочтительно получают из штаммов Aspergi11us

oryzea.

Определение активности амилоглюкозидазы.

При стандартных условиях, т. е. при РН 4,5 и температуре 55,0 С, определяют удельную активность растворимой амилоглюкозидазы, а также удельную активность иммобилизованно45 го фермента, которая определяется как количество фермента или ферментативного продукта, которое гидролизует водный раствор, содержащий 30% (вес.об) мальтозы, с начальной скоростью 1 мкмоль мальтозы в минуту. Активность иммобилизованного фермента определяют 5О в процессе периодического действия на образце, который поддерживают в суспенэированном состоянии с помощью встряхивающего устройства.

Определение активности грибковой а -амила- 55 эы.

При стандартных условиях, а именно при

РН 5,6 — 5,7, температуре 37,0 -0,05 С и в при9 9214

70 10 на колеблющемся грануляторе (например типа, поставляемого фирмой Диаф А/S, Копенгаген), снабженном ситами с отверстиями 1,5 мм.

Гранулированный продукт промывают обессоленной водой (10 л) в течение 10 мин, извлекают фильтрованием и затем подвергают сушке в кипящем слое. Высушенный продукт (1600 г, 450 ед, амилоглюкозидазы на грамм) освобождают от тонких частиц просеиванием.

Пример 3. В 400 мл водопроводной воды готовят раствор 105 г высушенного в струе порошка амилоглюкозидазы, полученной по примеру 1, и 105 r высушенного распылением альбумина и оставляют его на ночь в холодильнике при 6 — 7 С, рН раствора 5,4. 3атем добавляют глутаровый алъдегид (100 мл

50%-ного водного раствора) и полученный раствор добавляют в течение 3 мин к тщательно перемешиваемой навеске гранулированного соляной кислотои осажденного казеина (725 г того же сорта, что и применяемый в примере

1) . Смешение осуществляют в промышленной мешалке типа, используемого в примере 2.

Тщательное перемешивание смеси йродолжают в течение нескольких минут, после чего ее оставляют в покое примерно 1 ч для завершения реакции образования поперечных связей.

Полученные агрегаты и кусковой продукт гранулируют на колеблющемся грануляторе через сито диаметром 2 мм.

Гранулированный продукт промывают водщам раствором ацетата натрия(2рН 4,2) и затем сушат в вакууме при 35 С.

Активность высушенного гранулированного продукта (925 г) равна 800 ед. на грамм, что соответствует 67,8% первоначальной активности.

II р и м е р 4. Иммобилизованный амилоглюкоэидазный продукт, приготовленный по примеру 3 (20 г), вымачивают при комнатной температуре в течение 1 ч в водном растворе глутарового альдегида (500 мл 1 -ного раствора, регулируемого до рН 7,0), после чего осуществляют извлечение высушенного продукта (20 г). !

Активность полученного продукта 625 ед. на грамм, т, е. на второй стадии иммобилизации относительная активность составляет 7%, а полное извлечение из растворимой амилоглюкозидазы — 53%, Пример 5, Водный раствор мальтогеннгенной альфа-амилазы (2 мл 5%-ного раствора

Фунгамила 1600 (Ново Индастри А/S, Дания) в деиониэированной воде при рН 6,2) смешивают с водным раствором глутарового альдегида (0,3 мл 50%-ного раствора) и затем быстро добавляют к сухой смеси гранулированного кислотой осажденного казеина (4/0 r типа М 60) и промышленного яичного альбумина, высушенного распылением (0,5 r) . тоэы (с ДЕ-величинами от 35 -до 60) и остаточные олигосахарндъ1, остающиеся в маточной жидкости после кристаллизации декстроэгя или в рафинатах, получаемых при фракциоиировании фруктозы и Глюкозы. ПредпочГителъиы растворы5 декстрина с содержанием сухого вещества в пределах от 20 до 55% (вес.об.}.

" -Н р и M е р 1. Относителъно ниэкосортный гранулированный казеин, осажденный соляной кислотой (9 г пищевого каэеина, выпускаемо- 1о го фирмой Сцерма С. А., Франция, и содержащего частицы размером 100 — 500 мкм, причем фракция от 300 до 500 мкм составляет примерно 60%) смешивают с промышленным яичным алъбумином, подвергнутым струевой rs, сушке (1,2 г). К этой смеси добавляют предварительно смешанный раствор порошка amr логлюкозидазы (6,5 мл 18,5%-ного водного раствора), содержащего в сумме 12500 ед. амилоглюкозидаэы и глутаровый альдегид 20 (1,2 мл 50 -ного водного раствора). Порошок амилоглюкозидазы представляет собой ультрафильтрованный высушенный в струе продукт, приготовленный из амнлоглюкозидазы Ново (Ново индастри А/S, алания). Смесь тщательно 25 измельчают в ступе и затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Получаемые агрегаты измельчают в ступе с получением гранулированного продукта, которому дают возможность высохнуть при комнатной темпе- 30 ратуре в течение одного дня.

Активность высушенного гранулированного продукта (11,4 г) составляет 425 ед. на грамм, что ооставляет 38,8%.

Пример 2, Гранулированный кисло- з той осажденный казеин (1500 г типа М 60

Сперма С. A., содержащего частицы размером

100 — 500 мкм, причем фракция от 150 до

350 мкм составляет примерно 70%) смешивают в сухом состоянии с продажным высушен- 4О ным в струе альбумином (120 r) в 20-литровой горизонтальной мешалке.

Ультрафильтрованный концентрат амилоглюкозидазы, приготовленный из Амилоглюкози дазы Ново (650 r раствора, содержащего при- 45 мерно 25% сухого вещества и примерно

3200 ед. растворимой амилоглюкозидазы в 1 г концентрата), тщательно смешивают с глутаро вым алъдегидом (180 мл 50 o-ного водного раствора) при рН 4,9 и при температуре 18 C.

Полученный раствор вливают в смеситель.

Тщательное перемешивание осуществляют в течение еще полминуты илн одной минуты, а затем влажный осащ енный продукт удаляют из смесителя..Влажный npogyxò оставляют, в

55 покое примерно 45 мин для завершения процесса образования поперечных связей, в .резуль- . тате чего образуются куски агрегированных частиц, Гранулирование продукта осуществляют .

1,3

13,9

11 92147

После тщательного измельчения в ступе полученный продукт выдерживают 1 ч при ком.натной температуре. Куски измельчают в ступе, после чего продукт сушат при комнатной температуре в течение одного дня. 5

Пример 6. Колонку диаметром 15 мм, снабженную рубашкой и подцерживаемую при

55 С, загружают 5,7 r иммобилизованного амилоглюкозидазного продукта, приготовленного по примеру 1. 1О

В колонку подают с постоянной скоростью

15 мл в час сверху вниз сырье, содержащее

30% (вес. об.) промышленного кислотой (ферментом гидролизованного декстрина (СРС

Сноу Флэйк Малтодекстрин 01915 Д.Е.20), t5 имеющего следующий примерный cocras, %:

Глюкоза 4 — 5

Дисахарнды 8 — 9

Трисахариды 6 — 7

Тетра-и олнгосахариды 79 — 82 2О к которому добавляют 0,2% (вес.%) сульфнта натрия и затем регулируют рН до 4,5.

Вытекающий поток анализируют методом жидкостной хроматографии при высоком давлении (МЖХВД). Полученные данные представ- 2$ лены в табл. 3.

П р и и е р 7. В колонку диаметром

25 мм, снабженную рубашкой и поддерживаемую при температуре SS С, загружают иммобилиэованный амилоглюкозидазный продукт зр (20 г), приготовленный по примеру 2.

В колонку снизу вверх подают сырье. той же концентрации, того же состава и рН, которое используется в примере 6. Скорость подачи постоянна и равняется 50 мл. в час. 3"ексокииазным методом определяют . содержание глюкозы. Полученные данные указаны в табл.2.

Пример 8. В колонку с внутренним диаметром 25 мм, снабженную рубашкой и поддерживаемую при температуре 55 С, загружают 4о . иммобилизованный амилоглюкозидазный продукт (25 г), приготовленный по примеру 2, В колонку подают снизу вверх сырье состава, используемого в примере 6. Сырье (рН 4,5) содержит сухого твердого вещества 30% (вес. 4 вес.) и с добавками 2 r на литр сорбата калия в качестве противостарителя. Скорость потока регулируют таким образом, чтобы поддерживать примерно постоянную степень превращения.

Вытекающий поток анализируют МЖХВИ;

Определяют величину конверсии глюкозы в зависимости от времени. Данные представлены в табл. 3.

После, завершения эксперимента не отмечается никаких изменений твердости и других физических свойств материала насадки колонки.

Пример. 9. Следуя процедуре примера 7, но заменив иммобилизованный амило0 l2 глюкозидный продукт примера 2 тем, который приготовлен по примеру 4, получают результа- ты, представленные в табл, 4.

П р н м е р l0. Иммобилиэованную мальтогениую эльфа-амилаэу, приготовленную по методике примера 5 (4 г), загружают в колонку с рубашэ-ой, поддерживаемую при температуре 45 С и полают сверху вниз сырье — промышленный. декстрин (СПС Сноу Флэйк Мальтолекстрин 0191.3), содержащий

307с (вес.o6) твердого сухого вещества и 02% сульфита натрия в качестве лротивостарителя. рН сырья регулируют до 4,S и скорость потока устанавливают равной 15 мл в час

В табл. 5 указан состав вьпекающего иэ колонки потока, причем дисахариды представлены главным образом мальтоэой.

ll р и м е р 11, А). В колонку с внутренним диаметром 15 мм, снабженную рубаш,кой и поддерживаемую при температуре 55 С, загружают 12 r иммобилнэованной амилоглюкозидазы, приготовленной по методике примера 2.

В колонку подают сверху вниз декстриновое сырье (31% (sec/sec), в расчете на содер- жание сухого вещества), приготовленное расжижением крахмала с Термамилом 1 60 (торговое название, фирмы Ново Индастри А/S, Дания), и имеющего следующий состава,%:

Глюкоза 1

Дисахариды 7 — 8

Трисахариды 10-12

Тетра-и олигосахариды 79 — 82

Д. Е. 21

В сырье в качестве противостарителя добавляют 0,2% (вес./об,) сульфита натрия, и сырье имеет рН 4,5. Поток, регулируют таким образом, чтобы поддерживать постоянную степень конверсии(исходя из процентного содержания глюкозы). Вьпекающий поток анализируют

МЖХВД. В табл. 6 представлены полученные результаты. в). Декстриновый субстрат, приготовленный о методу, описанному в разделе (А) и имеющий следующий состав,%:

Глюкоза 1,1

Дисахариды 6,8

Три сахариды 11,0

Тетра-и олигосахаридьь 81,0 обрабатывают 001%-ной (из рассчета на содержание сухого. твердого вещества) мальтогенной альфа-амилазой (Фунгамил 1600, Ново-Индастри

А/В) при рН 5,0 и при 50 С в течение 2 ч.

После обработки получают следующий состав субстрата %:

Глюкоза

Дисахариды

921470

91,2

91,7

Три сахариды 223

Э

91,9

Тетра-и олигосахариды 62,5

Каждую из двух колонок с внутренним

1,0 92,4 жетроь4 15 мм имеющих Рубашку лодд

55 С ф амилом и им фунгамило ример,1 с ь соким сод ржанием мальтозы (Д,Я. примерно 42), испольдают сырье сверху вниз причем сырье соде содеР ра 6 с иммобилизованной амилоглюкозидазой. приготовленных в соответствии с данным опи- >0 .Скорость потока ег ли ют (о 73 час) ы, чтобы на выходе иметь сироп ы о и онверсией (Д.Е. примерно 65), имеющии следующии состав,%.

Глюкоза 38,1

1\1аксимальная ДХ-величина на выходе перед Дисахариды . 39,6 обработкой декстрина фунгамилом равна Трисахариды 23, 92,7%, а максимальная ДХ-величина на выхо- . Тетра-и олигосахариды 19,6 де после обработки декстрина фунгамилом Пример 14. В

93,3%. р и м е р . колонку, имеющую

П име 12. 10гпо внутренний диаметр 25 мм и снабженную р р . г порции иммобили- рубашкой, при температуре 550 С загружают зованной амилоглюкозидазы, приготовленной 2О .иммобижз

> .иммо илизованныи амилоглюкозидазный пропо методике примера 2, размачивают в 100 мл щ-т (20 ) гу, приготовленный по примеру 3. растворов, содержащих различные концентра- В колонку снизу вверх подают сырье, ции сульфита натрия. РН раствора доводят содержащее маточную жидкость(или рафинат), до 4,5 добавлением уксусной кислоты. Пос- полученную из фруктозо-глюкозного фракциоле размачивания в течение 2 ч при комнатной .пирования, имеющее следующий состав, %: температуре образцы ферментов промывают - Фруктоза деионизиРованной. водой и загРУжают в кблон- Глю

3,25 люк оза ки,с внУтРенним диаметРом 15 мм, слаб- Дисахари сахариды 9,17 женные рубашкой и поддерживаемые при Тр оС риса хариды 142

Более высокие сахариды 0,54

В колонки подают сверху вниз потоки сырья, содержащего декстрин 30% (вес./об.), ричем р доводят до 4,5, а скорость потока приготовленный по методике пРимеРа 11А концентрации 25% (вес,вес.) Состав аа в оде и к котоРомУ добавлено 0,2% (вес./об.) сор- из колонки f)JQQ3 из колонки, определенный МЖХВД, следуюбата калия с последующей регулировкой 35 щий,%: р до,5.

Н до 4,5.

Путем регулирования скорости потока Глюкоза 91,16

4,14 в каждой колонке из условия достижения максимУма ДХ-значениЯ на выходе полУчают Трисахари риса хариды следующие результаты:

Сульфит натрия, Максимальное ДХ Преищчцеством предлагаемого изобретения г 100 мл % является относительно низкая стоимость получа0 90,3 емых препаратов, так как их получение осно.0 01 90,2 вано на использовании сравнительно недоро45 гостоящих промышленно легко получаемых

0,1 носителеи и друтих вспомогательных материа0,2 лов.

921470

0,7

5,6

1,7

95,3

92,0

0,6

4,2

2,0

95,8

93,2

0,7

2,5

95,4

92,9

95,8

0,6

2,5

3,2

7 936

0,7

95,5

3,1

93,3

92,6

94,9

0,8

3,3

3,2

94,9

3,6

0,9

92,6

I

Та бл ица 2

Содержание глюкозы, %

89,0

93,6

93,6

93,1.

Таблица. 3

115

92,6

112

101

92,4

Дии Глюкоза, % Йисахариды, %

Трисахариды, %

Тетра- и олигосахари,%

16 .

Таблица 1

Расчетное

Л.Е

921470, 17

92,0

92,2

92,3

92,6

92,0

Таблица 4

Содержание глюкозы, %

90,3

93,7

Таблица 5

Концентрация, %

28,3

21,0

42,5

45,4

28,5

42,1

21,6

5,0

41,7

29,2

44,1

4,7

4,4

41,2

29,4

22,7 козы дисаха- трисаха- тетраолиго ридов ридов сахаридон

18

Продолжение табл. 3

Вычисленное Д.E.

921470

Та бл "ица 6

Концентрация, %

Скорость потока, Ma/÷ глюкозы дисахаридов трисахаридов тетра-и олигосахар

4,2

0,7

92,1

3,1

7. 3,6

0,8

92,3

0,7

З,б

92,2

3,5

28

3,1

92,4

3,6

3,3

92,1

3,7

0,8

15

Составитель О. Скородумова

Техред Л.Пекарь Корректор Г. Решетник

Редактор М. Петрова

Заказ 2402/78 Тираж 505 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и октрьпий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Формула изобретения

1. Способ получения иммобилизованного осахаривающего ферментного препарата путем связывания осахаривающего фермента с нераст воримым носителем с помощью глугарового альдегида, о т л и ч а ю щ н и с я тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта, в качестве носителя используют гранулированный казеин, а связывание осуществляют при перемешивании в водной среде при дополнительном присутствии яичного альбумина при следующих соотношениях компонентов: фермент: носитель (0,02 — 0,2):1; фермент: аль. .6умин (0,2-1,5):1; глутаровый альдегид: фермент с альбумином (0,2 — 04):1 и содержа,нии воды в реакционной смеси 30-60 вес.% с последующими механическим дроблением полученного. продукта и сушкой.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве осахаривающего фермента используют амилоглюкозидазу или зз а -амилазу.

3. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что.размер частиц носителя составляет 100 — 500 мкм.

4. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и и - . с я тем, что глутаровый алъдегид используют в виде 50 o-ного водного раствора.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе (1. О. О. Lee, J. J. Lee, 6. Т. Tsao. Continuons Production of G1ucose from 0ektrin

by 61ucoamy1ase immobi1ized on Porous Si1ica, "Die Starke, 1975, Nr. 11, 27, 384 — 387 (прототип).