Способ разделения эритроцитов на строму и гемоглобин

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗО6РЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Сеюэ Севетскнк

Сецнапнстнчаскнк

Республик

«»940066 (61) Дополнительное к авт. свнд-ву— (22) Заявлено 1 О. 12. 79 (21) 2888453/28-13 (5I)M. Кл.

G 01 N 33148 с присоединением заявки М— Ьеударстввай кекктвт

CCCP ав дааак взвбрвтеккй и аткритМ (23) Прноритет—

Опубликовано 30 ° 06 82 Бюллетень рте 24 (53) УДК 612.111 (088.8) Дата опубликования описания 30. 06 .82 (72) Автор изобретения

Г. П. Григорьев (7I) Заявитель (54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ HA ГЕМОГЛОБИН

И СТРОМУ

Изобретение относится к биохимии, а именно к исследованию крови.

Известен способ разделения зритроцитов на строму и гемоглобин путем гемолиза эритроцитов с последующим отделением гемоглобина от стромы биофизическим методом Pl ).

Однако способ не обеспечивает высокого выхода целевых продуктов.

Цель изобретения - увеличение выl0 хода целевых продуктов.

Поставленная цель достигается тем, что в способе разделения эритроцитов на гемоглобин и строму путем гемолиза эритроцитов с последующим отделением гемоглобина от стромы биофизическим методом гемолиэ ведут при рН 6,1-6,5, а гемоглобин отделяют от стромы ионообменной хроматографи° ей. 20

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Разделение эритроцитов на строму и гемоглобин осуществляют пропусканием гемолиэирован ных эритроцитов через слой молекулярного сита, помещенного в сосуд, имеющего катионообменные группировки, связывающие гемоглобин в слабокислой среде. Иэоэлектрическая точка гемоглобина рН=6,8, а изоэлектрическая точка стромы эритроцитов pH=5,8,no" этому при рН 6,1-6,5 строма приобретает отрицательный заряд, а гемоглобин положительный. В этих усло" виях гемоглобин прочно связывается с катионообменными группами молекулярного сита, а строка остается в окружающей среде. Последующая операция заключается в промывании содержимого сосуда укаэанным выше буфером до отрицательной реакции промы" вных вод на белок.

В первых порциях оттекающей жидкости получают взвесь стромы эрит" роцитов, полностью свободной от ге« моглобина. После отмывания стромы в сосуд вносят Na"ôoñôàòíûé буфер

0066 ф

26

Формула изобретения

ВНИИПИ Заказ 4659/66

Тираж 887 Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 94 рН 7,4, которым снимают гемоглобин с молекулярного сита, и последующим отмыванием в этом же буфере получают раствор гемоглобина, полностью лишенный остатков стромы. 2 мл отмытых от плазмы эритроцитов гемолизируют в 8 мл 10 мосм Na-фосфатного буфера рН 6,3. 10 мл гемолиэата помещают в сосуд, имеющий в нижней части сетчатый фильтр иэ инертного материала и сливное отверстие с кра. ном, заполненный 2 г СИ-Сефадекса, набухшего в 10 мосм натрий-Фосфат ном буфере рН 6,3 в течение 10 ч. Содержимое сосуда тащательно перемешивабт. Затем открывают кран и проИзводят промывание содержимого сосу да укаэанным выше буфером. Собирают фракции по 50 мл. В каждой фракции определяют концентрацию стромального белка.

Наибольшую концентрацию стромы находят в 2-4 фракциях. Фракции, содержащие строму, объединяют и под-.: вергают однократному центрифугированию при 6000 об/мин в течение

20 мин. Получают 2,8 мл взвеси стромы с концентрацией по белку 1,8 мг/мл и отрицательной реакцией на гемоглобин (определяют цианатным методом ). Выход стромы составляет 1003.

Содержимое сосуда промывают до отрицательной реакции на белок (8 фрак. ция),- затем производят см".:íó буфера. .Дальнейшее промывание производят

310 мосм фосфатным буфером рН 7,4.

При этом снимают адсорбированный на сефадексе гемоглобин. Концентрацию гемоглобина определяют фотометрическим методом.

Наибольшую концентрацию гемоглобина находят в 9-12 Фракциях. Эти фракции объединяют. Концентрация гемоглобина в объединенном растворе составляет 2,7 мг/мл, а выход в че" тырех фракциях по гемоглобину 903 от нанесенного на сефадекс. 8 последующих Фракциях(1.3-15 1 определяют незначительное количество гемоглобина

Общий выход по гемоглобину составляет

963.

fl р и и е р 2. 2 мл отмытых от плазмы эритроцитов гемолиэируют в

8 мл 10 мосм йа-фосфатного буфера рН 6,1 и приводят в соприкосновение с 2 г См-сефадекса, набухшего в этом же буфере.

Далее производят операции согласно примеру 1, Получают 2,5 мл стромы с концентрацией по белку 1,9 мг/мл.

Выход стромы составляет 983. В объединенных фракциях, содержащих гемоглобин, концентрация гемоглобина составляет 2,6 мг/мл, а выход по гемоглобину в 4-х фракциях -88>. Общий выход по гемоглобину составляет 96>.

Пример 3. 2 мл отмытых от плазмы эритроцитов гемолиэируют в

8 мл,l0 мосм Na-gocgaxworo буфера рН.6,5 и разделяют иа 2 г СМ-сефадекса, набухшего в этом же буфере. Далее производят операции согласно приме". ру

Получают 2,6 мл стромы с концентрацией по белку 1,8 мг/мл. Выход стром составляет 1003. Концентрация гемоглобина в объединенных фракциях составляет 2,8 мг/мл, а выход по гемоглобину - 93,3i, Общий выход

Ro гемоглобину 97,53.

Использование изобретения позволит получить высокоочищенные препа/ раты стромы и гемоглобина, необходимые при получении лекарственных препаратов иэ крови.

Способ разделения эритроцитов на гемоглобин и строму путем гемолиэа эритроцитов с последующим отделением гемоглобина от стромы биофизическим методом, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения выхода целевых продуктов, гемолиз ведут при рН 6,1-6,5>а гемоглобин отделяют от стромы ионообменной хроматографией.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Физико-биохимические и цитометрические методы исследования эритроцитов. Барнаул, Алтайское книжное издательство, 1976, с.62-64.