Способ определения противомозговых антител

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 05.11.80 . (21) 3217653/28-! 3 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М.К .

А 61 К 39/395

Гееударстеелимй кемитет

СССР (53) УДК Ь 616-07 (088.8) Опубликовано 23.07.82. Бюллетень № 27

Дата опубликования описания 28.07.82 пв делам лэебретеиий и еткрмтий

Г. А. Вилков, И. Б. Вовченко, А. М. и P. А. Трапезонцева (72) Авторы изобретения

Ростовский государственный ордена медицинский институт (7!) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТИВОМОЗГОВЫХ

АНТИТЕЛ

Изобретение относится к медицине, а именно невропатологии, и может быть использовано для определения противомозговых антител, обладающих нейтропной активностью, в сыворотке крови больных некоторыми нервно-психическими заболеваниями (острый энцефаломиелит, рассеянный склероз, шизофрения и др.), а также в условиях эксперимента для определения степени сенсибилизации к мозгу.

Известен способ определения противомозговых антител путем исследования сыворотки крови больного (1).

Однако известный способ длителен и трудоемок, так как забор ткани проводится через 24 ч после введения сыворотки, затем следует проводка в формалине, заливка, приготовление срезов, окраска на липиды и последующее микроскопическое исследование образца. Проведение исследования требует наличия в штате клинической лаборатории врача-морфолога и лаборанта-морфолога.

Целью изобретения является ускорение и упрощение способа.

Цель достигается тем, что при осуществлении способа определения противомозговых антител путем исследования сыворотки крови больного отличительной особенностью является то, что сыворотку крови больного смешивают с гомогенатом мозга крысы и комплементом, выдерживают смесь 18—

20 ч при ф — 12 С, и определяют наличие противомозговых антител по увеличению активности кислой протеазы по сравнению с исходной на 20% и выше.

Способ осуществляют следующим обра1о зом.

У больного из вены берут кровь 2,5 мл, приготавливают сыворотку и мл этой сывороки с 0,1 мл комплемента добавляют к

1 мл 20%-го гомогената мозга крысы, приготовленном на физиологическом растворе (гомогената мозга одной крысы достаточно для проведения 5 исследований). Отбирают аликвотную часть, центрифугируют и в надосадочной жидкости определяют активность кислой протеазы. Оставшуюся часть смеси

2о выдерживают 18 — 20 ч при 8 — 12 С, затем центрифугируют для отделения осадка и в надосадочной жидкости определяют активность кислой протеазы.

Активность кислой протеазы исследуют, используя в качестве субстрата гемоглобин

944581

Т а б л и ц а 1

До инкубации

После инкубации

0,230 32 387,4 0,365 48

581,0

П р и и е ч а н и е: 387,4 — 1003

581,0 — х х = 1503 з и выражают в мгк тирозина на 100 мг ткани. Увеличение активности фермента после !

8 ч пребывания в холодильнике минимум на 20О/о-ов по сравнению с исходными величинами свидетельствует о наличии в исследуемой сыворотке противомозговых антител.

Пример 1. Б-ной Г. 38 лет. Диагноз: рассеянный склероз, церебро-спинальная форма, экзацербация. Проведено обследование.

Из вены берут 2,5 мл крови, готовят сыворотку и l мл этой сыворотки с 0,1 мл комплемента добавляют к 1 мл 20О/р-го гомогсната мозга крысы, который был предварительно приготовлен путем гомогенизации 1 г мозга в 5 мл физиологического раствора. Отбирают половину обьема и ставят на инкубацию в холодHльник при 10 С на !

8 . Вторую половину центрифугируют в те«ние 15 мин, при 5000 об/мин, а затем к

0,2 мл IK нтрифугата добавляют 0,4 мл

0,005 М апета ro-фосфапнн о буфера (рН 3,8) в 0,2 мл 20", „-го раствора гемоглобина, смесь инкубируют 1 и прн 37"С. Реакцию останавлнвакп. 0,8 мл 20О/о-ой трихлоруксусной кис 101ой TÕ» ) . в KQIITpoëüíóâ пробу ТХУ ,lo6d B,Tÿê>T до субстрата (геомоглобина) .

11ослс остановки реакции трихлоруксусной кислотой пробы цеи грифугируют 15 мин при 5000 об/мин и к мл центрифугата добавляют 2 мл 9,5 и. ХаОН и 0,5 мл реактива Фолина (разведенного перед употреблением в 2 раза). Пробы колориметрируют при длинс волны 680 нм, и результат выражают в мкг тирозина (100 мг ткани за 60 мин).

Активность кислой нротеазы проведена в таол. .

Г1ревынцение активности фермента после инкубации сыворотки крови с мозгом соста вляст 50 /p, что позволяет заключить о значительном количестве антител в исследуемой сыворотке.

Пример 2. Больной Г., 35 лет. Предположительный диагноз: маниакально-депрессивный психоз. Проведено обследование.

Из вены берут 3 мл крови, готовят сыворотку и 1 мл ее с 0,1 мл комплемента добавляют к мл 20 /»-го гомогената мозга крысы, который готовят предварительно путем гомогенизации 1 г мозга в, 5 мл физиологического раствора. Половину объема помещают на инкубацию в холодильник при

l0 С на !8 ч. Вторую половину центрифугируют в течение 15 мин при 5000 об/мин, затем к 0,2 мл центрифугата добавляют 0.4 мл ацетато-фосфатного буфера (рН 3,8) и

0,2 мл 20О/o-го раствора гемоглобина. Смесь инкубируют 1 ч при 37 С. Реакцию останав15 ливают добавлением 0,8 мл 20 /o-ой трихлоруксуснои кислоты (ТХУ) . В контрольную пробу ТХУ добавляют до субстрата (гемоглобина). После остановки реакции трихлоруксусной кислотой пробы центрифугируют

15 мин при 5000 об/мин и к 1 мл центрифугата добавляют 2 мл 0,5 н NaOH и 0,5 мл реактива Фолина (разведенного перед употреблением в 2 раза). Пробы колореметрируют при длине волны 680 нм, а результат выражают в мкг тирозина (100 мг ткани

2s за 60 мин) .

Активность кислоты протеазы приведена в табл. 2.

Предварительный диагноз — маниакально-депрессионный психоз, диагносцированный клинически, подтвержден лабораторным зо исследованием, так как аутоиммунныи компонент, свойственный шизофрении, в данном случае отсутствует.

Предлагаемый способ прост, высокоспецифичен и надежен и может найти широкое применение в клинике для определения противомозговых антител в сыворотке крови больных с целью ранней диагностики нервно-психических расстройств аутоиммунной природы.

944581

Таблица 2

До инкубации мкг/100мг Е

0,290 29,4 366,0 0,210 28 338,0

П р и м е ч а н и е: 366,0 — 100 ь

338,0 — х х = 923

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор П..Коссей Техред А. Бойкас Корректор Ю. Макаренко

Заказ 5186/4 Тираж 714 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам Изобретений и открытий

113035, Москва; )К вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент>, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ определения противомозговых антител путем исследования сыворотки крови больного, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, сыворотку крови больного смешивают с гомоЗо генатом мозга крысы и комплементом, выдерживают смесь 18 — 20 ч при 8 — 12 С и

После инкубации

I 1- -" определяют наличие противомозговых антител по увеличению активности кислой протеазы по сравнению с исходной на 20% и выше.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

l. Авторское свидетельство СССР № 657807, кл. А 61 В 10/00, 1976.