Способ определения степени цитопатогенности нейссерий

 

О0 ИСАНИЕ

И 30БРЕТЕ Н ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскнх

Соцнапнстнческни

Респубпнк (i t) 958496

Ф

?.

1 а.(6! ) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 30.12.80 (2! ) 3256649/28-13 с присоединением заявки М (23) Приоритет (5I)M. Кл.

С 12Н 100

9Ьеударетеапай кенитет

СССР ао аелаи изобретений и открытий

Опубликовано 15.09.82. Бюллетень йЪ 34 (53) УДК 576.8.093 (088.8) Дата опубликования описания 15.09.82 (72) Авторы изобретения

Г. P. Газизова, Г. И. Рузаль, О. П. Галеева и М. В. Ермолаева ! т. ° .. ? !

Казанский научно-исследовательский институт э идемийдгий н микробиологии Бт1ь.ИИО ЖкА (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ЦИТОПАТОГЕННОСТИ

НЕЙССЕРИЙ

Йэобретение относится к медицине, а именно микробиологии.

Известен способ определения степени цитопатогенности нейссерий путем инфицирования клеточной культуры сусцензией микроорганизмов с последующим подсчетом количества дегенерированных клеток (1).

Однако известный способ является длитель ным и недостаточно чувствительным.

Цель изобретения — ускорение и повышение чувствительности способа.

Укаэанная цель достигается тем, что согласно способу определения степени цитопатогенности нейссернй путем инфицирования клеточной культуры суспензией микроорганизмов с последующим подсчетом количества дегенерированных клеток в качестве клеточной культуры используют однослойную культу ру перевиваемого амннотического эпителия человека, предварительно синхронизированную выдерживанием при 10Ю,1 C в течение 3 ч, при этом инфицирование проводят последовательно суспензией микроорганизмов, содер. жащей 2.108у1 4 104 H 8 10в р 2 8 104 мик

2 робных тел/мл, н подсчет количества дегенерированных клеток проводят через 6 и 24 ч инкубации.

Пример 1. Готовят однослойную

18-часовую культуру клеток в пробирках при посевной дозе 400000 — 50000 клеток на мл. среды, используя маточную перевиваемую культуру амниотнческого эпителия человека общепринятым методом. Для выращивания клеток используют среду 199 с о ,10% сыворотки крупного рогатого скота и. антибиотиками (пенициллин 100 ЕД/мл, стрел. томицин 50 ЕД/мл). Штатив с пробнрочными

18-часовыми культурами клеток помещают в рефрижератор с температурой 10 С на

3 ч для синхронизации клеточной культуры.

Испытуемую- культуру нейссернй 16 — 20часового роста на сывороточном агаре Хоттингера смывают физиологическим раствором (рН 7,0 — 7,2) и готовят мнкробные взвеси

20ЕД и 5 ЕД по национальному стандарту

ГИСК, что соответствует 2 10 и 5 10 микробных тел в 1 мл. Перед заражением в культуре клеток проводят смену росто.

Составитель Е. Ярных

Техред Т. Фанта Корректор Г. Огар Редактор М. Келемеш

Заказ 6983/37

Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 95 вой среды на поддерживающую среду 199 без сыворотки и антибиотиков. Затем приготовленные микробные взвеси испытуемого штамманейссерий в объеме 0,4 мл вносят в 3—

4 пробирки с клеточной культурой, т.е. по

8 10 и 2 ° 10 микробных тел на пробирку с культурой клеток. Доза 8 ° 10 микробных тел вызывает четко выраженный цитопатичеь кий эффект через 6 и 24 ч после заражения клеток в зависимости от степени вирулентности испытуемых штаммов менингококка и не дает ответной реакции клеток в случае, непатогенных нейссерий. Доза с содержанием

2 ° 10 микробных тел является пороговой .для менингококков при наблюдении через

24 ч после заражения и ареактнвной для непатогенных нейссернй.

Для контроля клеточной культуры оставляют 4 пробирки с поддерживающей средой, незараженными. Опытные и контрольные про. бирки инкубируют при 37 С в течение 24 ч.

Через 6 ч проводят первое чтение питопатического эффекта, наблюдая опытные клеточные культуры в сравнении с контрольными нод микроскопом при малом увеличении (об. 8х, ок. 10х). Цитопатический эффект оценивают по четырехкрестовой системе соответственно проценту погибших клеток: 100% (++++), 75% (+++), 50%(++), 25%(+) клеток монослоя. Отсутствие цитопатического эффекта обозначают знаком (-). Через 24 ч проводят второе чтение результатов.

Определение степени цитопатогенностн испытуемого штамма нейссерий проводят по ответной цитопатнческой реакции íà обе днффе. ренцирующие дозы нейссерий с учетом срока ее развития (6 ч или 24 ч). Высоковирулент ными менннгококками считаются те, „которые через 6 ч вызывают дегенеративные изменения у 75 — 190% клеток (для свежевьще8496 4 ленных штаммов) илн через 24 ч (для хранившихся штаммов). Вирулентными считаются штаммы менингококков, обусловливающие гибель 25 — 30% клеток на 24 ч, авирулентными — штаммы, не вызывающие цитопатнческого эффекта В контрольных пробирках дегенеративные изменения отсутствуют.

Способ определения степени цитопатогенноо ти нейссерий апробирован при изучении 16 о эталонных и 124 свежевыделенных штаммов нейссерий.

Использование изобретения позволяет улучшить диагностику менингококковой инфек циие

Формула изобретения

Способ определения степени цитопатогенноо ти нейссерий путем инфицирования клеточной культуры суспензией микроорганизмов с последующим подсчетом количества дегенерированных клеток, о:т л и ч а ю шийся, тем, что, с целью ускорения н повышения чувствительности способа, в качестве клеточной культуры используют однослойную культуру перевиваемого амниотического эпителия человека, предварительно синхронизированную выдерживанием при 10Щ1 С в течение 3 ч, 3О при этом инфицироваиие проводят последова- тельно суспензией микроорганизмов, содержащей 2 ° 10вН,4.10" и 8 10е12,8 104 микроб ных тел/мл, и подсчет количества дегенерированных клеток проводят через б и 24 ч инкубации.

Источники информации, принятые во внимание нри экспертизе

1. Дударева В. В. Менингококковая инфекция. Труды ЛСГМИ, Л., 1978, с. 63 — 65.