Способ получения активатора автолиза микроорганизмов

 

(72) Авторы изобретения

О.В. Кислухина, Т.А. Кузнецова, К.А. Калун

Всесоюзный научно-исследовательский биотех институт (Vl ) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВАТОРА АВТОЛИЗА

ИИКРООРГАНИЗИОВ

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, в частности к способам получения активатора автолиза микроорганизмов.

Наиболее близким к предпагаемому по технической сущности и достигаемо- .5 му эффекту является способ получения активатора автолиза микроорганизмов, предусматривающий гидролиз исходного сырья трипсином. о

Согласно известному способу регуляторы автолиза выделяют из ферментолизата биомассы микроорганизмов путем экстракции 5-103-ной трихлоруксусной кислотой с последующим осаждением из экстракта 5-6 объемами органических растворителей . ферментативному лизису подвергают суспенэии биомассы с: концентрацией сухих веществ 5"203.

Для лиэиса используют на первой стаго дии фермент литического действия, на второй стадии - фермент протеолити" ческого действия, например трипсин, 2 при соотношении фермент: субстрат

1:500 (1).

К недостаткам известного способа относится то, что регулятор автолиза может использоваться как для активации, так и для торможения автолиза, Характер действия регуляторов зависит от субстрата (автолиэирующейся бактерии ). Поэтому для выбора регуля" тора заданного характера действия на данный микроорганизм требуется проверка действия серии регуляторов, что осложняет проблему применения регуляторов автолиза на практике.

Кроме того, недостатками известного способа являются также сложность процедуры выделения регуляторов и необходимость специального оборудования, устойчивого к действию трихлоруксусной кислоты.

Цель изобретения - упрощение способа, а также повышение эффективности действия активатора автолиза.

3 96971

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения активатора автолиза микроорганизмов, предусматривающему гидролиз исходного сырья трипсином, гидролизу подвергают казеин или казеинат натрия, а гидролиз ведут в течение 0,5-24 ч при соотношении фермент : субстрат равном 1;1000 " 1:5000.

Способ осуществляют следующим об- 10 разом.

Казеин или казеинат натрия растворяют в воде, концентрация белка - от

1 до 54. При необходимости для улучшения растворения суспензию белка 15 подогревают до 60-80оС. По окончании процесса растворения температуру раст" ора снижают до 40-42ОС и устанавлиают рН 8-9 с помощью раствора ((аОН.

Затем в раствор вносят фермент трип- 20 син, соотношение фермента к субстрату от 1:1000 до. 1:5000. Ферментативный гидролиз проводят при 35-40 Г в течение, 0,5-24 ч, предпочтительно 2 ч.

По окончании гидролиза температуру 25 гидролизата повышают до 90-100оС и выдерживают при этой температуре 1530 мин для инактивации фермента. Затем гидролизат охлаждают и высушивают лиофильно или на распылительнай зв сушилке. При этом в качестве наполнителей могут быть использованы соли, например поваренная соль, сульфат аммония и др; (в зависимости от це" левого назначения препарата), коли35 чество вносимых при сушке солей50-1503 к сухой массе .гидролизованного белка.

В качестве гидролизуемого субстрата можно использовать не только казе- 4О ин или казеинат, но и другие белки, например молочный альбумин, бычий сывороточный альбуми н, желатину, íî rIo- лучаемый при этом активатор автолиза обладает менее выраженным действием.

Универсальность активирующего действия на автолиз различных микроорганизмов сохраняется.

Наиболее активная фракция активатора, получаемого из казеина или казеината натрия, содержит пептиды с моле. кулярной массой 800-1000. дальтон. С целью повышения эффективности активатора эта фракция может быть выделена из гидролизата методом гельфильтрации на сефадексе или акрилексе.

Пример 1. 50 г казеината нат- рия растворяют в 1 л воды при 70 С, охлаждают раствор до 40 С, устанавлиr> 4 вают рН 8,6 с помощью 1t-ного раствора МаОН и добавляют 0,01 r трипсина в виде водного раствора в объеме 0,01 л (соотношение фермента к субстрату

1:5000 ). Гидролиз ведут при 38 С и постоянном перемешивании в течение

2 ч. Затем гидролизат нагревают до кипения и выдерживают в кипящей водяной бане 15 мин, после чего охлаждают и лиофилизируют. Полученный препарат используют для активации автолиза микроорганизмов.

Для определения степени активации автолиза приготавливают однородные водные суспензии биомассы различных микроорганизмов со стандартной оптической плотностью 0,95 1,05 при измерении на ЗЭК-56М при длине волны

540 нм в кювете толщиной 5 мм.

Затем составляют реакционные смеси из равных объемов стандартной суспензии и водного раствора активатора концентрации 4 мг/мл. 8 контроле к стандартной суспензии приливают равный объем воды. Измеряют исходную оп- тическую плотность реакционной смеси

Do и оптическую плотность после инкубации в течение часа при 37 C — D,o.

Вычисляют интенсивность автолиза J

I 60 ;- 1003 .

D0

Полученные результаты приведены в таблице, варианты 1-10 (при продолжительности гидролиза 2 ч и соотношении фермент : субстрат 1 : 5000). Из таблицы видно, что в вариантах 3-9 интенсивность автолиза микроорганизмов возростает в 2,9-15 раз по сравнению с контролем, а в вариантах I и 2 наблюдается высокая интенсивность автолиза у микроорганизмов, которые в отсутствие активатора не лизировались. Это может объясняться переходом латентной формы автолитических

Ферментов в активную в присутствии активатора автолиза.

Пример 2. 100 г казеина растворяют в 2 л воды при 75ОС,охлаждают раствор до 40o(:, устанавливают рН 9,0 с помощbe 13-ного раствора

NaOH и добавляют 0 10 r трипсина в виде водного раствора в 0,10 л воды (соотношение фермент : субстрат 1:1000)

Гидролиз ведут при 40 С в течение

0,5 ч. Затем гидролизат выдерживают в кипящей водяной бане в течение

30 мин, после чего охлаждают и лиофилизируют. Полученный препарат испольВлияние активатора на интенсивность автолиза фли кроорганизвлов

Отношение опыт : конт роль

Интенсивность автолиза, 4

Вариант

Микроорганизм

Конт- Опыт роль

Streptonyces аlbog Г! зео105

0 56,7

В. t1esentericus 1

Bifidobacteritin

19,9

69,5 8,7

37,6 15,0

32,2 6,3

8,0

Е.coli HRE-600

2 5

Е. col i M17

Метанооки сляюцие бактерии, культура 122

5,5 16,2 2,9

Иетаноокисляюцие бактерии, культура 170

6,2 27,3 4,4

Lactobact.planta"

ГОГ

7,0 20,9 3,0

Candida tropicalis

ВСБ-909 4,9 14,! 2,9

Rhdotorula aurantiaca

8,4 25,0 3,0

5 9697 зуют для активации автолиза микроорганизмов. Определение степени активации проводят так, как описано в примере 1.

Полученные результаты приведены з в таблице, варианты 1-13 (при продолжительности гидролиза 0,5 ч и соотношении фермент : субстрат 1:1000 ).

Под действием активатора интенсивность автолиза метаноокисляющих бактерий, О культура 170, повышается в 4,2 раза, Е. coii И 17 - a 6,0 раз, а у актиномицета Streptomyces albogrlseolus - от

0 до 52,83.

И

Пример 3. 50 г казеината натрия растворяют в 2 л воды при 60 С,, охлаждают раствор до 42ОС, устанавливают рП 0,8 и добавляют 0,02 г трипсина в виде водного раствора в обьеме 20

15 d

0,02 л. Соотношение Фермент: субстрат равно 1:2500. Гидролиз ведут при

37 С в течение 24 ч. Затем гидролизат нагревают до кипения и выдерживают в таком состоянии 20 мин. По охлаждении гидролизат лиопилизируют.

Испытание активирующего действия препарата на автолиз микроорганизмов проводят так we,,êàê в примере 1.

Результаты приведены в таблице, варианты 14-17 (при продолжительности гидролиза 24 ч и соотношении фермент : субстрат 1:2500 ). Степень активации автолиза составляет для метаноокисляющих бактерий, культуры

122 и 170, соответственно 2,7 и 4,3 раза, для E. coli MRF-600 — 14,5 раза, у В. nesentericus 1 интенсивность автолиза повышается от 0 до

18,7 .

Микроорганизм

»»» »

Конт- Опыт роль

Иетаноокисляющие бактерии, культура 170

7 м

Продолжение таблицы

Вариант

Интенсивность автолиза, 4

Отношение опыт . контроль

62 250 42

5,1 30,6 6,0

12 Е, col i И17

13 Streptomycqs al"

bogriseo2us

52,8

14 Иетаноокисляющие бактерии, культу» ра 170

6,1

26,2 4,3 +® 15 Иетаноокисляющие бактерии, культура 122

56 151 27

16 E.col(HRE-680

2,5 36,2 14 5

18 7

В.mesentericus 1

Составитель В. Голимбет

Редактор Т. Лопатина Texpeg С.Мигунова Корректор М. Коста

Заказ 8314/27 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ (осударственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

11 035 Москва N-35 Разовская наб. д. 4/5

-«35 м

Ф филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

»»

Таким образом, предлагаемий способ ющий гидролиз исходного, сырья трипсиполучения активатора автолиза микроор- ном, о т л и ч à l0 шийся тем, ганизмов обеспечивает получение. высо- что, с целью упрощения способа, а коэффективного активатора автолиза,. также повышения эффективности действия который,, по сравнению с известным активатора ввтолиза, гидролизу подспособом позволяет активировать авто- вергают казеин или казеинат натрия, 35 лиз представителей всех групп микро- а гидролиз ведут в течение 0,5"24 ч организмов. Кроме того, достигается при. соотношении фермент, субстрат упрощение за счет исключения стадии равном 1:1000 - 1:5000. обработки трихлоруксусной кислотой. Источники информации, Формула изобретения . принятые во внимание пр экспертизе

Способ получения активатора авто- . 1. Авторское свидетельство СССР лиза микроорганизмов, предусматрива- ((759526, кл. С 07 (7/02, 1978.