Способ получения аминокислот

 

В.И. Сухаревич, В.A. Лазеба, В.И. Яковлев,/Ъ Ж ебабов, З.M. Зайцева, И.И. Шильникова и А.И. Лф ин „,.

Ф

1 с

Ленинградский ордена Октябрьской Революции и ордена

Трудового Красного Знамени технологический институт им. Ленсовета (72) Авторы изобретения (7!) Заявятель (54) СПОСОБ ПОЛУ4ЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ

Изобретение относится к микробиологической промыщленности, а именно к способам получения аминокислот.

Известные микробиологические cnocoGbl получения различных аминокислот, в частности лизина, гомосерина

S и т.д., предусматривают глубинное культивирование специальных мутантных ытаммов из родов Cor;inehacteriun и Вгечihacteriun на йерментационных питательных средах, содержащих ассимилируемые источники углерода (углеводы, ацетат, зтанол, углеводороды), источники азота (сульфаты или хлори» ды аммония, мочевина), соли hochopa или магния, микроэлементы (марганец, цинк, железо) и источники необходимых ростовых факторов (витамины, аминокислоты) .

Известен способ получения лизина, предусматривающий использование в качестве ростового (фактора гомосерин" содериащей культуральной жидкости (1).

Известны такие способы выращивания микроорганизмов на питательных средах, по которым с целью интенсификации процесса выращивания используют в качестве биостимуляторов внсокомо" лекулярные кислоты - продукты воднощелочного окисления керогена сланца, модийицированного кобальтом, в количестве 0,0001-0,013 или сланцевые кислоты в количестве 0,00025-0,00453 (2g и (3g.

Недостатком укаэанных способов является то, что, например, исполь" эование сланцевых кислот предусматривает выделение их из водно-щелочного оксидата с помощью специального метода на угле CKT при 200 С. Такое вы- деление сопряжено со значительными потерями монокарбоновых кислот, в ре" зультате чего количественное и относи" тельное содержине моно- и дикарбоновых кислот существенно отличается от содержания их в водно-щелочном окси975800

3 дате (ВЩО). Применение, например, сланцевых кислот при биосинтезе ли" зина не оказывает стимулирующего действия на этот процесс.

Наиболее близким к предлагаемому . по технической сущности и достигаемо" му эффекту является способ получения аминокислот путем глубинного культивирования продуцирующих их микроорганизмов на питательной среде, содержа- !О щей источники углерода, азота, минеральные соли и стимулятор роста в виде лейцинсодержащей культуральной жид-. кости, получаемой при культивировании мутантного штамма Вгеч1Ьасйвгium 4с 1З

tofermentun. При получении лизина по этому способу используют мутантные штамиы различных глутаматпродуцирующих бактерий из родов Corynebacterium и Brevibacterium (4).

Добавление лейцинсодержащей культуральной жидкостй иповышает выход лизина на 20-25l и соответственно увеличивает коэффициент конверсии. Иеханизм действия этого стимулятора неясен. До 15 бавление в среду чистого лейцина или культуральной жидкости штамма - продуцента глутаминовой кислоты подобного стимулирующего э Мекта не дает. Реализация способа связана с получением зв специальных лейцинпродуцирующих штам" мов у Brevibacterium lactofermentum, их предварительным культивированием, что существенно удорожает способ.

Цель изобретения - увеличение выхода аминокислот.

Поставленная цель достигается теми что по способу получения аминокислот, предусматривающему глубинное культивирование мутантных штаммовпродуцентов на жидкой .питательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота, минеральные соли и стимулятор роста, в условиях аэрации среды с последующим выделением целевых продуктов, в качестве стимулятора роста используют водно-ще лочной оксидат керогена сланца в ко" . личестве 5-103 от объема среды.

Оксидат получают известным мето< дом - путем окисления керогена кисло" родом воздуха в водно-щелочной среде при 200 С, давлении 30-40 атм в тече" ние 3-4 ч. Неокисленный остаток от" деляют от оксидата простым Фильтро" ванием.

Оксидат имеет следующий групповой состав Г/л:

Неор гани че с ки е ве" щества 185,0

Органические вещества 29,0

Органические кислоты 23, Ч

Ионокарбоновые кислоты - от уксус" ной до капроновой, дикарбоновые - от янтарной до себациновой.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

В качестве продуцентов лизина и гомосерина используют соответственно гомосерин и треонинэависимые мутанты

Corynebacter1un и Brevibacterium, например Corynebacter1um g1 utani cun 95 или B rev1bac te r i um s p 22Л. Культуру указанных штаммов, выращенную на агаризованной питательной среде Хоттингера, переносят в колбы с посевной средой и выращивают при постоянной аэрации и перемешивании в течение

,14-20 ч при 29+1,0 С. Затем посевной, материал в количестве 1-5 of>.4 переда" ют в ферментационную среду. Процесс биосинтеза осуществляют при интенсивной аэрации и перемешивании при 3032©С и рН 6,8-7,6. Продолжительность ферментации 64-60 ч. 8 состав ðментационной среды, помимо известных компонентов источников углерода (сахар, меласса), источников азота (сульфат, хлорид)q источников ростовых факторов (кукурузный экстракт или гомосеринсодержащая культуральная жидкость добавляют в количестве 5-10 об.7, специфический субстрат - водно-щелочной оксидат (8ЦО), получаемый, как указывалось, при водно-щелочном окислении керогена ВЯО.

После окончания процесса лизин получают в виде технического продуктакормового концентрата или в виде кристаллов одним из известных способов.

Пример 1. Односуточную культуру мутанта Corynebacterium g lutanicum

95, выращенную на косяках с агаром

Хоттингера, пересевают на жидкую посевную среду следующего состава, меласса 4,0; кукурузный экстракт йаСФ. 0,4.

Посевной материал выращивают в течение 16"24 ч в колбах на качалке при

28-30 С и затем в количестве 5 об.3 переводят в ферментационную среду, содержащую.

Сахар (сырец), Ж 10 (МН), 50„, 2,0

К НРО,, 0,10

975800

MgSO<, 0,05

Десбиотики, мкг!л 50

Гомосеринсодержащая культуральная жидкость, об, Ф 5 (0,5 г/л я расчете на гомосерин )

Водно-щелочной оксидат, об.7. 10

СаСО, > 1,0

IO

Выращивание проводят в колбах

Эрленмейера объемом 250 мл при объеме среды 20 мл и 30-32 С. Через

68 ч в культуральной жидкости накапливается продукт, количество которого дано в табл. 1. Выделение лизина ведут одним из известных методов.

Таблица 1

0 5

Гомосерин

Вариан Объем ВГ(О, среды об.3

Рост, ед.

О.П.

r/ë Ф к контролю7 (контроль1 10

398 97 100

8 10

9 (контроль1 20

Выход лизина эв

33,0 8,8 100 г/л к контроле

32 п 9 3 106

10 20

11(контроль 30

12 30

26,4 100

43,5 2," 100

31,5 7,5 288

10

37,3 I 41

10 10

Из, табл. 1 следует, что добавление 5ф

ВЩО в количестве 10 об.4 в среду с

103 сахарозы увеличивает выход лизина на 413 по сравнению с контролем (без В@О)., П р и и е р 2. Односуточную куль">5 туру мутанта Brevlbacterium flavun 2, выраценную на косяках с агаром Хоттингера, пересевают на жидкую посевную среду следуещего состава, Ф: меласс» 3,0; кукурузный экстракт 3,0; в

HaCf 0,4>.

Посевной материал выращивают в колбах на качалке при 28-30 С в течение о

18-24 ч и в количестве 5 об.3 передают в Йерментационнуе среду, содержа- <5 щую:

Сахароза, Ф 10 (NH4$ 504, 9 2 э 0

К НРО4, Ф- 0,15

Няьо .7и,о, ".. 0,05

MnS04. 5H 0, 0,001

FeS04 7Н О, Ф 0,001

Десбиотин, мнг/л

Тиамин, мкг/л

Треонин, г/л

Водно-щелочной оксидат,об. l 10

С»СО . 9, 2,0

0 5

Культура Rrevihacteriun

11 0 - 10 16 6 100

<- 10 10 21,3

Сахар ВЩО, об.Ъ (сырец), Ф

Выращивание проводят в колбах Эрленмейера объемом 250 мл при объеме ферментационной среды 10 или 30 мл и в пробирках объемом 50 мп, содержащих 2 и 4 мл среды при 28-30 С. Через

72 ч в культурапьной жидкости накапливается продукт, количество которого дано в табл. 2.

Таблица 2

10 32,7 9,7 100

И з табл. 2 видно, что при высокой аэрации среды ВЦО практически не влиет на синтез гомосерина Brevibacte"

iun fiayum. При низкой аэрации добавление ВЩО к основной среде приводит к увеличению в 3 раза выхода гомосерина Ro сравнение с выходом в контрольных условиях (беэ ВЩО1.

П р и и е р 3. Отличается от примера 1 тем, что в качестве берментационной среды используют среду следующего состава:

Иеласса, Ъ (no сахару) 11

Кукурузный экстракт, 3 2 (WH4$ S04 В 2

К НР04, 0 1

В610, об. Й 10

СаСО, 3 1,0

Данные по выращиванию культур пред ставлены в табл. 3.

Т а б л и ц а 3

7 975800 8

Продолжение табл. 3 ферментационную среду, составило . Д или 20 об.3.

Результаты представлены в табл.4, Лизин

»»» а лица

ВЦО, об. Ф

Объем среды, мл

Сахар мелассы

Сахар меласси

ВЦО, Объем г/л Ф к контролю

Лизин об.3 .среды мл г/л к контролю

30 10,4 100

10 30 22,5 217

110 - 30 104 100

11,0 5 0 30 20,5 197

Культура Corybacterium дfutamicum

7,5 30

11,0 " 10

17,0 100

22,0 211

21,5 207

27,7 167

16,9 100 31

27>6 167

10 10

10 30

11 0 20 >О 30 формула изобретения

ВНИИПИ Заказ 8936/43 Ьраж 505 Подписное филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Из табл. 3 следует, что при добав лении ВЩО в концентрации 10 об.3 в 25 ферментационную среду выход лизина увеличился на 28-217 ;, в зависимости от используемой культуры.

При использовании культуры Arevi"

bacterium f1avum выход лизина значи" зе тельно колеблется, в зависимости от интенсивности аэрации, и в условиях ухудшенной аэрации (30 мл среды) влияние ВЩО особенно эффективно2174 55

Это свойство ВЦО монет быть использовано для снижения расходов на аэрацию увеличения выхода и соответственно удешевления лизина при его производстве.

При использовании другого продуцента, - Cnrynebacterium 01utamicum 95 добавление Rti0 в среду в условиях различной аэрации {10-30 мл среды или сульйитное число 3,2-1,2 20 r О /луч соответственно) приводит к одинаково" . му увеличению выхода лизина на 673 по сравнению с выходом в контрольных условиях (беэ. ВЩО).

Пример 4. ферментацию Brevlbacteri.um sp 22ЛД проводят в условиях примера 3. В отличие от примера 3, количество ВЦО, вносимого в

Наибольший эффект был получен при введении в среду 10 об.Ф ВЩО.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить выход аминокислот на 67-3003 против 20-253 по известному.

Способ получения аминокислот путем глубинного культивирования мутантных ытаммов - продуцентов на жидкой питательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота, минеральные соли и стимулятор роста, в условиях аэрации среди с последующим выделением целевых продуктов, ототличающийся тем, что, с целью увеличения выхода аминокислот, в качестве стимулятора роста используют водно-щелочной оксидат керогена сланца в количестве 5-103 от объема среды.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

l. Авторское свидетельство ГССР

М 675981,. кл. С 12Р 13/06, 1977. .2. Авторское свидетельство СССР

М 653900, кл. С 12 В 3/14. 1977.

3. Авторское свидетельство СССР и 875850, кл. Г 12 Р 7/48, 1980.

4. Патент США И 3952076, кл, 261-41, опублик. 1976.