Способ определения устойчивости хлопчатника к вилту

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских .Социалистических

Рвспублик

IIIi988244 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 12. 09 ° 80(213 2983094/30-15 с присоединением заявки Мр М gN з

A 01 Н 1/04

Госуяарственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (23) Приоритет (53) УДК б31. 52 (088.8) Опубликовано 15.0183. Бюллетень М 2.

Дата опубликования описания

) с

К.Алиев, to. С. Насыров, M.Анв аров а и Г. В.-Щ5рагимова::. -. -„.

Институт физиологии и биофизики растений Х

АН Таджикской ССР =- / (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОИЧИВОСТИ ХЛОПЧАТНИКА

К ВИЛТУ

Изобретение относится к селекции на иммунитет к,боЛезняМ и может быть использовано в сельском хозяйстве.

Известен способ определения устойчивости хлопчатника к вилту, при котором перед посевом хлопчатника производят заражение почвы возбудителем данного заболевания 1).

Однако данный способ требует боль- 1О ших затрат времени и труда и не всегда приводит к .желаемым результатам, так как проявление заболевания в ес. тественных условиях зависит от почвенно-климатических условий.

Известен также способ определения устойчивости хлопчатника -к вилту, при котором проводят гибридизацию молекул

ДНК, вь целенной иэ хлопчатника с ме" ченной ДНК-С, полученной из возбу- 2(1

- днтеля вилта хлопчатника и по степени гибридизации судят о степени устойчивости Г2.1

Данный способ не позволяет получать неповрежденную ДНК иэ растений, а высокая гибридизуемость между ДНК хлопчатника и гриба затрудняет опре-, деление вилтоустойчивости.

Цель изобретения --ускорение определения вилтоустойчивости и повьш вние его точности.

2 з

Поставленная цель достигается тем, Йто проводится реакция.аминоацетилирования тРНК-ферментОм аминоацил-тРНК-синтетаэы,выделенной на .разных по устойчивости сортов и по1эа-. меняемости ферментов определяют степень устойчивости к заболеванию. Таким образом проводят выделение тРНК из устойчивых к вилту сортов хлопчат" ника и аминоацил"тРНК-синтетазы - ив неустойчивых и по заменяемости ферментов судят о степени устойчивости к заболеванию.

Пример ° 100 г эамоченных в бидистиллированной воде семян раатйрают в ступке с 200 мл 0,05 И ацетат ного буфера, рН 7,0 содержащего

1мг/мл бентонита, 0,03 M+8, 0,01И меркаптоэтанола до гомогенной массы.

Гомогентат центрифугируют 40 мин при

20000 об/мин, к надосадочной .жидкости добавляют додецилсульфат натрия (SOS) до конечной концентрации 0,5Ъ-ной и равное количество водного фенола и перемешивают при комнатной температуре 20 мин. Водную фазу .отделяют цент рифугированием 10.мин. прй 5000 об/мин, обрабатывают смесью. хлороформ-.иэоамиl ловый спирт (24sl) и центрифугируют

5 мин при 5000 об/мин. Из водного

988244 жащвй 100 мкМ таис -НСВ буфере рй 7, 3,15 мкм К»соли АТФ, 20 мкM М СЕ

2.мкМ 2-меркатозтанола. Конечный объем 1 мл.

Инкубацию проводят 10 мин при

30 С..Реакцию останавливают добавлением 0,1 мл 20%-ной ;трихлоруксусной кислоты и осйждают тремя объемами спирта. Осадок отделяют центрифугированием,10 мин при 3000 об/мин.

Осадок промывают 70%-ным холодным спиртом 10 раэ, растворяют 10%-ным раствором ИаСР и пропускают через колонки с свфадексом Г-100 (размер колонки 300 мм 12 мм). Радиоактивность проб просчитывают на диаксановом сцинтиляторв-счетчике МАРК-2 °

Процент заменяемости фермента опрвделяют. по степени аминоацилирования тРНК устойчивого сорта. Ташкент 1 ферментом 108 Ф и С 4727, т.е. по уровию включения С " -сврина в акцепторную часть тРНК этими ферментами. данные, приведенные в таблице показывают, что фермент из восприимчивых сортов (108 Ф и С 4727) имеет процент эамвнявмости от 30 дд 50%, а фермент иэ устойчивого сорта Ташкент 1 - 80-90%, т.е. фермент иэ невосприимчивого сорта, почти полностью ацилирувт тРНК восприимчивых ,сортов. Таким образом, фермент неус тойчивых сортов не способен полностью ,ацилировать тРНК устойчивого сорта Ташкент 1, что указывает на репрессивность генома семян, ответственного за кодирование определенных иэоформ аминоацил тРНК синтетазы специфичные к серину.

В таблице представлена активность аминоацил"тРНК-синтетаз в реакции аминоацнлирования сврил-тРНК.

Предлагаемый способ позволяет очно и быстро определить устойчивость хлопчатника к вилту в лабораторных условиях на уровне семян.

Источник выделения

Удельная активность тРНК, имп/мин мг PHK

Аминоапил-тРНК

Синтетаэ

TPHK

Сорт, Сорт

Ташкент-1

28.200 Рашкент-1

108-Ф

С-4 727

100

26.250

108-Ф

С-4727

100

18.250

100 с лоя осаждают РНК добавлением 2,5 объема холодног© спирта и оставляют на ночь для формирования осадка, PHK отделяют центрифугированием 10 мин при 4000 об/мин, промывают несколько

:раз холодным спиртом.. осадок PHK раст- 5 воряют в воде, содержащей 10%-ный Ка)СЗ и оставляют на несколько часов дляЪормирования осадка. Выпавший осадок PHK выделяют центрифугированием 10 мин ,при 4000 об мин. К надосадочной жид- 3Q ости снова добавляют 3 объема холодо спирта. Осадок тРНК собирают цвнтрифугированием, как указано выне, тРНК растворяют в холодной воде и добавляют 1%-ный ЙаОН до рН 10,0 и ин- g кубируют при 37 С 1 ч для освобождения тРНК от аминокислот. Раствор тРНК нейтрализуют 1 М СНаСООН на хо" лоде н очищают на колонке с свфадвксом (r-100) ° ьминоацил-тРНК"синтвтазы получают гомогенизированнвм семян хлопчатника в 0,025 Моррис -НСИ, буфере рН 7,5, содержащем 0,01 М 10%-ный глицерин,.

0,01 М мвркап озтанола (на 100 г семян добавляли 200 мл буфера) и центрнфугнруют 20 мин при 20000 об/мин. .Надосадочную жидкость снова центрифугируют 60 мин при 40000 об/мин.q

К надосадочной жидкости добавляют сухой сульфат. аммония до 17%-ного на- -30 сыщения. Осадок отделяют центрифугированием 20 мин при 15000 об/мин. надосадочной жидкости медленно в течение 2 ч добавляют сухой сульфат аммония до 37%-ного насыщения и ос- д тавляют на 2-4 ч для формирования осадка. Осадок отделяют центрифугированием 20 мин при 1500 об/мнн. растворяют в вышеуказанном буфере и освобождают от пРимесей пУтем диалиэа на ночь. Фермент концентрируют с по лощью сефадекся Г-200.

Реакцию аминоацилирования проводят следующим образом. 0,5 мл тРНК (0,2 мг) инкубируют с 0,1 мл аминоацил-тРНК-синтетазой (0,1 мг) в присутствии <+C-серина в среде, содерЗаменяемость фермента, %

988244

Продолжение таблицы

Удельная активность тРНК, имп/мин мг PHK Источник выделения заменяемость фермента, Ъ

Аминоацил-тРНК .Синтетаз

TPHK

«ф

108-Ф 20.120

Ташкент-1

Ташкент-1

С-4727

16.790

50

108-Ф

С-4727

Ташкент-1 13.650

Ташкент-1 6.400

Формула изобретения

Состав и тель М. Дран ишни ков

Редактор В.Ковтун Техред Е.Харитончик Корректор О.Билак

Заказ 10911/3 Тираж 719 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент, r.ужгород, ул.Проектная,4

Способ определения устойчивости хлопчатника к вилту, включающий тестирование семян на возбудителе даннога заболевания, о т л и ч а ющ и и с. я тем, что, с целью ускорения процесса определения и повышения его точности, проводят реакцию аминоацилирования тРНК-ферментом

:аминоацил-тРНК-синтетаэы, выделенной иэ разных по устойчивости сортов и по заменяемости ферментов определяют степень устойчивости к эаболеванию.

25 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Информационные фоны в фитопа тологии. Научные труды ВАСХНИЛ, М., Колос 1979 с 104 105

30 2. Авторское свидетельство СССР

9 511917, кл. А 01 Н 1/02, 1974 (прототип).