Способ получения антибиотика g-6302

 

Иностранцы

Акира Имада, Казуаки Китано и М (Япония) Авторы изобретения

Ин остр ан н ая фир гла

"Такеда Кемикал Индастриз, ЛТД (Япония ) (71) Заявитель (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

G-6302

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения антибиотика

G-6302 °

Цель изобретения — создание способа получения антибиотика G-6302.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения антибиотика Формулы 10

""т. Ск «0(g3

1 н % я

ИО С-С-Си; Сн; С-М -С-С-3 г

Н 0, М "Î,О " бОъя

t5 штамм P seudomonas acedophi l a G-6302

ATCC-31363 культивируют в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, с последующим отделением культуральной жидкости и выделением целевого продукта.

При этом, с целью повышения выхода целевого продукта, культивирование ведут на питательной среде, со- 25 держащей дополнительно метионин, цис теин, цистин, сульфат натрия или тиосульфат натрия, Используемый для осуществления способа штамм Pseudomonas G-6302 вы- З0 делен из проб почвы, собранных в районе Ашигара-Мимон-Гун, Префектура Канагава, Япония, депонирован в институте Ферментации, Осака (1ГО) под номером IГО 13774 и характеризуется следующими признаками.

Яультурально-морфологические признаки.

По истечении 2-х дней нва питатель.— ном скошенном агаре при 28 С клетки приобретают форму стержней диаметром

0,7-1,0 мк и длиной 0,7-3 5 мк. Подвижная с полярно расположенной жгутиковой зооспорой или полярно расположенным жгутиком, неполиморфна. Неспорулирующая: без накопления полибета-оксимасляной кислоты в качестве внутриклеточного углеродного запаса.

Грам-отрицательная, кислотонеустойчивая. При выращивании при 28 С в течение 1-14 дней проявляет следующие свойства, На питательном агаре образует круглые колонии диаметром 1-3 мм с полным оФормлением кромок по истечении 3-х дней; однородные: непрозрачные, белые, растворимый пигмент отсутствует.

1003761

Питательный скошенный агар. Рост умеренный, нитевидной формы, непрозрачный, кремовой окраски.

Жидкая питательная среда. Мутное новообразование, практически без седиментации. По истечении 14 дней культивирования образует тонкую пленку.

Питательный желатиновый столбик, Поверхностный рост, без разжижения.

Физиолого-биохимические свойства.

Лакмусовое молоко не изменяет.

Нитраты в нитриты не восстанавливает. Денитрификация отрицательная.

Проба на метиловый красный отрицательная. Проба Воджес-Прокауэра отри-15 цательная. Сероводород образует (слабо положительная реакция). Крахмал не гидролизует. Нитрат калия усваивает слабо, сульфат аммония усваива ет. Пигмент не образует. Уреаза положительная, оксидаза отрицательная, каталаза положительная.

Растет при рН 4-8, оптимум рН

4,5-6,0, температуре от 2 до 37 С, оптимум роста при 25-30 С. 25

Аэроб. Окислительно-ферментативная проба — оксилительная.

На средах с сахарами слабо образует кислоту, гаэ не образует.

Ассимиляция источников углерода: хорошо усваивает арабинозу, D-ксилозу, 0-глюкозу, D-маннозу, 0-фруктозу, мальтозу, сахарозу, трегалоэу, 0-сорбит„ D-маннит, инозит, глицерин, альфа-метил-D-глюкозид, адонит, раффинозу, цис-аконитат, цитрат, изоцитрат, глюконат, ацетат, фумарат, малат, тартрат, п-оксибензонат, оС -аланин, бета-алании, L-изолейцин, сукцинат, 2-кетоглюконат.

Не усваивает лактоэу, крахмал, мелибиозу, дульцит, L-валин.

Малонат не использует.

Фенилаланин не деаминирует.

Декарбоксилаэная активность: ар- 45 гинин — отрицательная, лизин — отрицательная, орнитин - отрицательная реакция.

Эскулин гидролиэует.

Содержание гуанин-цитозина в дезоксирибонуклеиновой кислоте

59,5 мол.Ъ.

Способ осуществляют следующим образом, Для культивирования штамма G-6302 могут быть использованы такие источники углерода, как глюкоза, сахароза,.мальтоза, отработанная меласса, глицерин, масла и жиры, органические кислоты. В качестве источника азота - органические и неорганичес- 60

«е азотсодержащие соединения, например соевая мука, мука хлопковых семян, кукурузный экстракт, сухие дрожжи, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, мочевина, сульфат аммония нитрат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония. Неорганические соли хлорид натрия, хлористый калий, карбонат кальция, сульфат магния, первичный кислый фосфат калия, вторич-. ный кислый фосфат натрия ° Выход антибиотика можно повысить путем доО бавления соединений серы — сульфат натрия, тиосульфаты, серосодержащие аминокислоты — цистеин, цистин, метионин. Концентрации соединений серы поддерживают в питательной среде на уровне 0,01-1,0Ъ (вес,об.), предпочтительно 0,02-0,5Ъ (вес.об.). В питательную среду можно вводить соли тяжелых металлов, в частности сульфат двухвалентного железа, сульфат меди, а также витамин В, биотин.

Культивирование в жидкой среде проводят в стационарных условиях при перемешивании, встряхивании в аэробных условиях. Температура культивирования от 15 до 35 С, рН питательной среды 4-8, Культивирование проводят в течение 8-168 ч, предпочтительно от 24 до 144 ч °

Антибиотик может быть выделен обычными способами, используемыми при выделении антибиотиков, а именно отделением клеток центрифугированием с последующей очисткой целевого продукта растворением в растворителе или осаждением из раствора, ионообменной хроматографией и др.

Пример 1. Клетки микроорганизма Рseudomonas асidophi1а 0-6302 (FE КИ-P Р 4344, ГО 13774; ARTCC-31363) выращенные на питательном скошенном агаре, используют для ионокулирования двух 2х10 об.ч. колб Сакагучи, содержавших по 500 об.ч. среды, которая включает в себя 1Ъ глюкозы, 0,5Ъ продукта полицептон, 0,5Ъ мяс-ного экстракта, 0,5Ъ хлористого натрия, величина рН 7,0, после чего каждую колбу инкубируют на возвратнопоступательном встряхивателе при

28 С в течение 48 ч. Конечную культуру используют в качестве посевной культуры.

Ферментер из нержавеющей стали емкостью 200 х 10 об. ч. заполняют

120 х 10 об.ч. среды, которая включает в себя ЗЪ глицерина, 0,1Ъ глюкозы, 0,5Ъ полипептона, 0,5Ъ мясного экстракта и 0,5Ъ хлорида натрия, и после доведения величиры рН до 7,0 добавлением 30Ъ-ro водного раствора гидрата окиси натрия ее дтерилизуют водяным паром при 120 С в течение 20 мин. Затем среду стерилизованного сосуда инокулируют указанной посевной культурой и инкубируют при 28 С с аэрацией при скорости подачи 120 х х 10 об.ч./мин скорости вращения мешалки 180 об/мин в течение 78 ч.

Конечный бульон подвергают центрифу1003761

65 гированию с помошью сепараторной центрифуги с плавным рабочим режимом для отделения клеточной массы, в результате получают 110 х 10 об.ч. верхнего слоя жидкости. Величину рН этой жидкости доводят до .4,2 и про5 пускают через колонку с 15 х 10 об.ч.

3 активированного древесного угля. Колонку промывают 45 х 10 об.ч. э

50%-ro водного раствора ацетона, элюат собирают в виде 10 х 10 об.ч. фракций. Отбирают фракции 2 и 3, проявляющие активность в отношении f roteus mirabi1is, добавляют 20 х 10 об.ч. воды и смесь пропускают через колон3 ку, заполненную 10 х. 10 об.ч. смолы 15

Даукс (хлорионная форма) . Колонку промывают 25 10 об.ч. воды и элюируют 50 10 об.ч. 5%-го водного раствоЪ ра хлористого натрия. Отбирают активные фракции, доводят рН до 4,0 и 2О вновь пропускают через колонку с ак тивированным древесным углем (8 . 10 об.ч,). Колонку промывают

24 10 об.ч. воды и элюируют 20%-ным водным раствором метанола (объем/ 25

/объем) ° Отбирают активные фракции и.концентрируют до 50 об.ч. при пониженном давлении. Затем добавляют

200 об.ч. ацетона, осадок отфильтровывают, промывают 50 об.ч. ацетона и 100 об.ч, диэтилового эфира и высушивают при пониженном давлении.

Получают 12 частей сырого продукта.

В 500 об,ч. 0,01 M фосфатного буфера (рН 6,6 ) растворяют сырой продукт и раствор пропускают через колонку с 200 об,ч. продукта ДЕВЕ-сефадекс А-25, предварительно обработанного буфером. Колонку промывают

400 об. ч. того яе буфера, а затем элюируют тем же буфером, в который 40 предварительно добавляют 0,5% хлорис того натрия. Отбирают активные фракции, доводят рН до 3,21 н. НС1 и пропускают через колонку с 60 об.ч. активированного древесного угля. Ко- 45 лонку промывают 200 об.ч. воды и

100 об.ч. 20%-ro (объем/объем) водного раствора метанола с последующим элюированием 50%-ным водным раствором ацетона (объем/объем). Отбирают gp активные фракции, концентрируют при пониженном давлении и растворяют в

5 об.ч. метанола. Добавляют 100 об.ч. ацетона, смесь выдерживают на холоде.

Образовавшийся осадок отделяют филь- 55 трованием, промывают диэтиловым эфиром и высушивают при пониженном давле. нии пентоксидом фосфора при 40 С в течение 6 ч ° Получают 3,8 частей порошка.

Антибиотик обладает следующими

Физико-химическими свойствами. температура плавления 120 С (спекание ), 330 С (c разложением).

Белый порошок. Молекулярный вес

400 + 20 (титрометрия ).

Найдено, %: С 34,83-35,45; Н 5,41

5к24 N 13ю22 13с73 т S 7r65 7s75e

О 38,13+0,5.

Н М Ь 0 Н 0

w1.i.о 4

Спектрограмма ультра-Фиолетового поглощения: только конечные частоты поглощения (никаких характеристических поглощений при длине волны свыше

210 нм), Спектрограмма инфра-красного поглощения, доминантные пики (бромид калия ), см 1: 3440 (си ), 2920 (cp ), 2850 (cp ), 2600 (сл ) 1770 (си ), 1650 {си),,1530 (си),.1458 (cp), 1390 (сл)

1340 (сл ), 1280 (пл ), 1240 (си ), 1210 (пл ), 1180 (cp ), 1118 (сл ), 1043 (си ), 792 (сл ), 632 {си ), где си — сильное, ср — среднее, сл — слабое поглощение, пл — плечо.

Удельное вращение (плоскости поляризации ) Id I 3+94 +10 (С-0,35, вода).

Спектрограмма ядерно-магнитного резонанса (в диметилсульфоксиде, 100 мГц) 5 3, 31 pprn (S — определенный химический сдвиг в направлении

О-СН ), Нерастворим в петролейном эфире, гексане диэтиловом эфире, бензоле, I

4 этилацетате и хлороформе, умеренно растворим в этаноле, пиридине и ацетоне, растворим в метаноле и диметил сульфоксиде; легко растворим в воде.

Цветные реакции. Положительные с нингидрином и перманганатом калия, отрицательные — с хлоридом трехвалентного железа — феррицианидом калия, Сакагучи и Молиша; неопределенно положительные — реакция Эрлиха.

Стоек в водном растворе в интеро вале величин рН 3-7 при 60 С в течение 10 мин, нестоек при рН выше 8,5.

Кислая реакция.

Пример 2. В ферментационный сосуд из нержавеющей стал . емкостью

50-10 об.ч. загружают 35 " 10 об.ч. среды, которая содержит 3% глицерина, 0,1% глюкозы, 0,5% полипептона, 0,5% мясного экстракта, 0,5% хлористого натрия, затем величину рН этой среды доводят до 7,0 добавлением 30%ro водного раствора гидрата окиси натрия и стерилизуют водяным паром при 120 С в течение 20 мин. Затем среду инокулируют продуцентом. Рнкуо бируют при температуре 28 С аэраз цией при скорости подачи 35 10 об. ч./мин и скорости вращения мешалки

180 об/мин в течение 48 ч., получая вторичную посевную культуру.

Ферментационный сосуд из нержавеющей стали емкостью 200 10 об.ч. заполняют 12001 10 об.ч. среды, ко3 торая включает 3% глицерина, 0,1% глюкозы, 0,5% полипептон а, О, 5% мяс1003761 ного экстракта, 0,5;. хлористого натрия и 0,1-- тиосульфата натрия, а после доведения рН до 7,0 добавлением ЗОЪ-го раствора гидрата окиси нат рия среду стерилизуют водяным паром при 120" С в течение 20 мин. Затем среду инокулируют вторичной посевной культурой.

Инокулированную среду инкубируют, при 28 C при аэрации со скоростью 10 подачи 1200,10 об.ч./мин и скорости вращения мешалки 180 об/мин в течение 90 ч, в результате получают

1150*10 Об.ч. культуральной жидкости. 15

В нее добавляют 40 10 ч. продукта Хифло-Супр- Сел и фильтруют с помощью Жилот-пресса,. Величину фильтрата доводят до 4„? добавлением 4н, H 5 04 н г ропускают через колонку с

120- 10 О .ч. активированного древес а ного угля. Колонку проживают 300

10 Об. ч. водь:, элюируют 50-.-ным (объем/Объем ) водным раствором ацетона, Отбирают активные фракции и концентрируют при пониженном давлении для удаления ацетона. ПолУченный водный концентрат разбавляют 200 °

10 об.ч. воды и пропускают через 3 колонку, заполненную 50 10 об.ч. продукта Дианон S A-21K (хлорионная

Форма ). Колонку про .ывают 1Ъ-ным водным растворОм хлОристОгО натрия.

Собирают активные фракции и концентрируют при пониженном давлении до конечного объема 100 об.ч., после чего добавляют 2 ° 109 Об.ч. метанола и выпавший в осадок хлористый натрий отфильтравь.вают. После этого фильтрат концентрируют при ПОниженнОМ давлении до Объема 200 Об.ч., а за- 40 тем добавляют 2 -10 Об.ч ацетона, выпавший в Осадок продукт отделяют фильтрованием и высушивают, Получают 757 ч. сырого продукта, 500 ч., сырого продукта растворяют в 5 10 об. ч, воды, доводят ве«плчин рН до 4,0 и адсорбируют в колонке на активированном древесном угл= (5 10 «об,ч. ), 3

Активный компонент злюируют по методу градиентного злюирования с исполь. 50 зованием 10"10 Об.ч., воды и 10 10 об.ч. 70Ъ-го водного раствора ,Ъ метанола (объем/объем) и злюат собирают 1.10 об,ч. фракций. Активные фракции Отбирают, концентрируют при пониженном давлении для удаления метанола и доводят обьем до б -10 Об.ч. добавлением 0,01 М фосФатного буфера (рН 6,0 }. Пробный раствор для адсорбции пропускают через колонку с 3 ° 10 об.ч. продукта ДЕАК-Cl--Фадекс A-25, приготовленный согласно примеру 1 затем колон1 . P ку промывают 6 10 Об. ч. того же бу, фера, причем элюирование производят, тем самым буфером, в который добав- 65 ляют 0,5Ъ хлористого натрия, злюат собирают в виде 500 об.ч. фракций.

Активную фракцию отбирают, доводят рН до 3 1н, HCl и пропускают через колонку с 0,5 ° 10 об.ч. активированного древесного угля. Колонку промывают 2 ° 10 об.ч. воды и 2 ° 10 об.ч.

20%-ro водного раствора метанола (объем/объем), а затем элюируют

503-ным водным раствором ацетона (объем/объем). Отбирают 200 об.ч. фракций. Активные фракции концентрируют при пониженном давлении и растворяют в 300 об.ч. метанола. Добавляют 3 10 об.ч. ацетона и 4 10 об.ч. дизтилового эфира и оставляют на холоде, выпавший осадок антибиотика

Отфильтровывают, промывают дизтиловым эфиром и высушивают при пониженном давлении над пятиокисью Фосфора.

Выход 72 r. Данные элементарного анализа, %: С 35 45, Н 5 24, N 13 73, S 7,75 (вес/вес).

Пример 3. В 90 об.ч. воды растворяют 4,0 ч. антибиотика G-6302 в свободной форме (по примерам 1 и 2) на холоде и добавляют в раствор приблизительно 9,0 об.ч. 1н. водного раствора NaOH. Затем добавляют дополнительное количество 1н. раствора

Na0H до достижения величины рН 6,5, Раствор высушивают вымораживанием, получают 4,2 мононатриевой соли

G-6302 в виде белого порошка.

Физико-химические свойства. Отсут- .ствует определенная температура плавления (приобретает коричневую окрас ку при 170 С), Белый порошок. Молекулярный вес

438 5.

Найдено, %: С 33,08, H 5,07, М 12,73, S 7,33, Na 5,18.

С Н N,S0 Na Нд 0

Вычйслено, Ъ: С, 33,03, Н 4,85, М 12,84, 5 7,35, Na 5,27.

Спектр ультрафиолетового поглощения: только конечные поглощения.

Спектрограмма инфра-красного поглощения, доминантные пики (бромистый калий), см : 3430 (си ), 3250 (пл), 3000 (ср), 1770 (си), 1640 (си), 1530 (си), 1450 (сл), 1405 (сл), 1343 (сл), 1280 (пл), 1245 (си), 1180 (сл), 1118 1050 {си), 820 (сл), 782 (сл), 632 {си).

Удельное вращение: М.l + 85 +

+ 10 (С-0,37, вода). Нерастворим в петролейном эфире, гексане, диэти ловом эфире, бенэоле, этилацетате, хлороформе и ацетоне, слабо растворим в метаноле, этаноле и пиридине, растворим в диметилсульфоксиде, легко растворим в воде.

Цветные реакции. Положительные— с нингидрином и перманганютом калия, отрицательные - с хлоридом трехвалентного железа — Феррицианидом ка1003761

10 таллы отделяют, промывают небольшим количеством 80%-ro (объем/объем) холодного водного раствора метанола, затем последовательно холодным метанолом и диэтиловым эфиром высушивают над-пятиокисью фосфора при пониженном давлении и температуре

60 С в течение 6 ч и добавляют

0,930 ч. кристаллов, полученного антибиотика.

Полученные кристаллы имеют следующие физико-химические свойства.Температура плавления от 168 до 170 С. о

Найдено, %: С 35,51-35,56, Н 5,615,61, N 12,93-12,93," S 7,45-7,59.

С Н ц 509 Сньон. Oi5 н2.0

ВычИслено, Ъ: С 35, б 9; Н 5, 76; и 12,81, S 7,33, Удельное вращение: 1ю(.1т, + 82 +

+ 5 (С = 1,0, в воде), Инфра-красный спектр поглощения, доминантные пики (бромистый калйй), см : 3440, 3355, 3000, 1780, 1660, 1650, 1538 1265, 1245, 1220, 1038, 625.

Спектрограмма ядерно-магнитного резонанса (в диметилсульфоксиде, 100 мГц): С, 3,31 ppm (Sg.ЗН) (определенный химический сдвиг в сторону

О-СН 6-6302), Д 3,320 ppm (Б Ц) (определенный химический сдвиг в сторону -О-CH> . метанола, который содержится в кристаллах)..

Антибиотик G-6302 и его натриевая соль активны в отношении грамотрицательных и некоторых грамположительных бактерий (см. таблицу).

Антимикробный спектр G-6302 и его натриевой соли

Микроорганизм

25

25

12,5

12,5

25

12,5

12,5

100

100

100

100

25

100

100 лия, Сакагучи и Молиша; неопределенно положительные — реакция Эрлиха.

Стоек в водном растворе в интер-о вале величин рН 3-7 при 60 С в течение 10 минутного нагревания, нестоек при величинах рН выше.8,5.

Пример 4, Клетки микроорганизма G-6302, выращенного на питательном скошенном агаре, используют для инокулирования питательной среды (40 об.ч ° ), содержащей 1% глюкозы, 10 .0,5Ъ полипептона, 0.,5% мясного экстракта и 0,5Ъ хлористого натрия (рН

7,0), затем колбу с инокулированной средой инкубируют на роторном встряхивателе при 28 С в течение 48 ч и l5 получают посевную культуру.

Конические колбы емкостью по

200 об.ч. заполняют 40 об.ч. среды, содержащей 3% глицерина, 1% глюкозы, 0,5% полипептона, 0,5Ъ мясного экст- 2О ракта и 0,5% хлористого натрия (рН

7,0) добавляют в каждую колбу 0,02О,ЬВ различных соединений серы с по следующим инкубированием на роторном встряхивателе при 28 С в течение 96 ч.25

Дополнительное введение соединений серы позволяет повысить выход антибиотика (от 15 мкг/мп на обычной среде до 20-80 мкг/мл при добавлении различных серосодержащих соединений).30

Пример 5. В 7,5 об.ч, холодной воды растворяют 1 ч. антибиотика в свободной форме, затем в смесь добавляют 17 5 об.ч. холодного метанола. Смесь оставляют на холоде на 24 ч.

Получают порошок, кристаллизованный в виде бесцветных кристаллов. КрисEscherichiа со!i NIHJ

Escherichiа со!i T-7

Sa 1mone 1 la typhos a 8oxh i 11 58

Shigel1a Elexneri EM-10

К1ebsiе11а pneunon!ae DT

Pr oteus vulgaris IFO 3988

Proteus morgani c IFO 3168

Proteus mi rabi ) is iFO 3849

Serrati à marcescens 1ГО 12648

Pseudomonas aeruginosa U-31

Минимальная ингибирующая концентрация мкг мл

G-6302 и G-6302 а

Свыше 100 Свыше 100

1003761

Продолжение таблицы

Минимальная ингибирующая концентрация., мкг/мл

Микроорганизм

G-6302 и G-6302 а

Staphy1ococcus aureus FDA 209Р

Свыше 100 Свыше 100

Свыше 100 Свыше 100

Streptococcus pyogenes Е-14

100

100

12,5

12,5

Формула изобретения

1. Способ получения антибиотика

Составитель Г. Смирнова

Редактор А, Ворович Техред A.A÷ Корректор И. Ватрушкин а

Заказ 1611/50 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Вас111us subt I I i s PCT 219

Corynebacterium diphteria Toronto

Candida a1bicans IFO 0583

SacCharomyces cerevisi ae !FO 0209

Aspergi11us niger IFO 4066

Penici11ium chrisogenum I F0 4626

Предлагаемый способ позволяет получить антибиотик, используемый для лечения заболеваний, вызванных перечисленными микроорганизмами, а также в качестве гермицида или дезинфицирующего средства. формулы

38 (ц 03м ь

Т яс с-с-си-сн -с-и-с-с-м и е с с с сЮ

Свыше 100 Свыше 100

Свыше 100 Свыше 100

Свыше 100 Свыше 100

Свыше 100 Свыше 100 заключающийся н том, что штамм Pseudomonas acedophi1à G-6302 ATCC-31363 культивируют в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, с последующим отделением культуральной жидкости и выделением целевого продукта, 2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю35 шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, культивирование ведут на питательной среде, содержащей дополнительно мети40 онин, цистеин, цистин. сульфат натрия или тиосульфат натрия.