Штамм гриба aspergillus niger л-4 продуцент лимонной кислоты

 

Союз Совет сник

Социалистические

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ ВИДЕТЕЛЬСТВУ (11)975799 (61} Дополнительное к авт. свнд-ву (22)Заявлено 13.06.80 (21) 2955606/28-13 с присоелииеиием заявки М (23) Приоритет (51)М. Кл.

С 12 и 15/00

0С 12 Р 7/48 (С 12 N 15/00

С 12 R 1/685) ($3) УЙК 661.734. .1(088.8) )Ьвударетвеный кевпет

CCCP яо авлаи яэебретеннй

Й Открытия

Опубликовано 23.11.82. Бюллетень М 43

Дата опубликования описания 25.11.82 (72) Авторы изобретения

В.П. Ермакова, F.ß. Щербакова, И.M. Bacu

В.И. Финько и Т.И. Шушкевич

69

i

Ленинградский межотраслевой научно-исследователь сйМЙ i:-" ., институт пищевой промышленности (71) Заявитель (54) ITAMM ГРИБА ASPERGiLLUS й1GER Л-4ПРОДУЦЕНТ JlHHOHHOA КИСЛОТЫ

Изобретение относится к микробио- логической промышленности и касается нового штамма гриба вида Asperg i I lus п1 Пег, продуцирующего лимонную кислоту.

Известны штаммы грибов Asperge llus п10ег P-1 и Л-106, используемые для получения лимонной кислоты поверхностным способом (1) и (2).

Продолжительность прорастания конидий у этих штаммов составляет 9 ч.

3а это время развивается сопутствующая микрофлора, угнетающая кислотообраэование основного продуцента.

Известен штамм Aspergillus niger

Л-l, используемый как продуцент лимонной кислоты в производственных yc" ловилх 1 3).

Однако этот штамм применим лишь ю для меласс с низкой исходной концентрацией по сахару.

Цель изобретения - получение штамма, обладающего высокой активностью образования лимонной кислоты при сбраживании мелассных растворов с высокой исходной концентрацией.

Г)тамм был получен в результате селекции штамма Л"1 под. влиянием комбинированного действия химических и Физических мутагенных факторов: диазоацетилбутана (ДАБ) и Уф-лучей,. диэтил" сульфата (ДЭС) и Уф-лучей, циклойос" фана (Цф) и Уф-лучей. После каждого способа обработки изучали кислотообразоввние у 100 мутантов. Наиболее эффективным оказалось комбинированное воздействие 13"ным раствором ДАБ в течение 3 ч и УФ-облучение в дозе

3,3 тыс.эрг/мм Таким образом, был селекционирован мутант Р 4, называемый далее штаммом Л-4 (Ленинградский-4).

Новый штамм обильно образует конидии бежевого цвета, являющиеся посев" ным материалом в производстве лимонной кислоты; конидии прорастают че975799

3, рез 6-7 ч. Штамм является более устойчивымым к бактериальной Флоре, сопутствующей производству лимонной кислоты, по сравнению с производствен" ным штаммом Л-1. 5

Штамм Л-4 является активным продуцентом лимонной кислоты как при поверхностном культивировании, так и в глубинных условиях при сбраживании мелассных сред повышенной концентрации при этом лимонная кислота s состаse синтезируемых кислот составляет

75-903.

Штамм Л-4 является активным кислотообразователем при поверхностном и глубинном культивировании на средах, приготовленных из мелассы.

При культивировании и глубинных условиях на концентрированных мелассных средах штамм Л-4 образует 9,44 кг, 2о

)2 лимоннои кислоты с 1 и в сутки, рас- ход 463 мелассы на 1 т лимонной кислоти - 2959 кг.

При поверхностном культивировании на мелассных средах штамм Л"4 об- И разует 2,026 кг лимонной кислоты с

1 м в сутки, расход 46 меласси на

1 т лимонной кислоты составляет

3173 кг.

Выход лимонной кислоты от сахара 30 составляет (при использовании штамма

Л 4) 753 в глубинных условиях и 693 при культивировании поверхностным способом.

Образование лимонной кислоты у штамма Л-4 изучено при различных режимах ведения процесса: в лабораторных опытах в глубинных условиях выращивания на мелассных средах с содержанием сахара 10 и !в

133 (табл. 1); в лабораторных опытах в глубинных условиях на разбавленных до 3> по сахару мелассных средах по заводской технологии (табл. 2);

4S в производственном цикле в цехе глубинной Ферментации Ленинградского комбината по производству лимонной кислоты на мелласных средах с исходной концентрацией сахара 103 (табл.3)1 в лабораторных условиях при поверхностном выращивании на стаканах, на мелассных средах, 15-ныx по сахару.

Результаты испытаний предлагаемого штамма Л-4 по сравнению с известным Л-1 сведены в табл. 1т3.

Иэ таблиц следует, что штамм Л-4 является более активным кислотообраэователем при всех испытанных режи" мах по сравнению с производственными штаммами. Продуктивность нового штамма на концентрированных средах, содержащих 9-15l сахара, возрастает на

11-2 .ii no сравнению с активностью производственного штамма Л-1 в тех же условиях.

Штамм гриба Aspergiilus niger Л"4 депонирован во "ВНИИГенетика" под номером Г-171. !!!тамм имеет следующую характеристику. !

1орфолого-физиологические признаки.

Морфологические свойства изучают у пятисуточных культур, выращенных при 3? С на среде 4апека.

Конидиальные головки круглой hopмы, диаметр их сечения 44-132 мкм, средний-диаметр головок 90,1 мкм.

Вздутие конидиеносца (пузырек) шароидной формы диаметром от 20 х 29 до

8-60 мкм, средний диаметр 44 х 36 мкм, Стеригмы двуслойные: длина стеригм парного порядка 6-32 мкм, в среднем

13,3 мкм. Стеригмы второго порядка длиной 5"10 мкм, в среднем 6,5 мкм.

Конидии круглые с толстой шиповидной кремовой оболочкой. Средний диаметр конидий 4,1 мкм. Конидиеносцы пряные бесцветные, длина конидиеносцев 4181265 мкм, ширина 9-20 мкм.

Интагонистические свойства штам" ма Л-4.

Подавляет развитие бактерий Е.соti, Васi 1)us sut t! tis, Вас!3 fus mesentericus, сопутствующих производству лимонной кислоты, и является более сильным антагонистом по отношению к этой микрофлоре по сравнению с производственным штаммом Л-1.

Культуральные и,биохимические признаки.

Сусло-агар. Колония быстрорастущая, достигающая на 5-е сутки в диаметре в среднем 8,6 см. Окраска колонии светло-бежевая. Воздушный мицелий сильно развит. В центре колонии конидиальные головки расположени плотно.

От центра к краю колонии конидиальные головки мельче. По краю колонии в радиусе 0,6 см светлая эона с незрелими белыми конидиальными головками„ плотно прижатыми к субстатному мицелию, Обратная сторона колонии гладкая белая.

975799

0,65

Среда Чапека. Колонии диаметром

8,1 см. Окраска колонии бежевая. В центре колонии конидиальные головки крупные, расположены плотно, образуют возвышение. К краю колонии величи- s на конидиальных головок уменьшается.

Нарастающий край в радиусе 0,5 см покрывают незрелые мелкие конидиальг ные головки. Обратная сторона колонии гладкая белая. 1Е

В отличие от производственного штамма Л-l новый штамм Л"4 образует более мелкие колонии. Иорфологически отличается от производственного штамма несколько меньшими размерами конидиальных головок и более длинными стеригмами первого порядка.

Новый штамм является более сильным антагонистом (по сравнению с исходным штаммом) по отношению к сопутст- 20 вующей бактериальной 4âoðå.

Пример 1, Выращивание кислотообразующего мицелия и биосинтез лимонной кислоты осуществляли в ла" бораторных условиях íà качалкеi типа

АВУ-50р с числом качаний 160 в мии в колбах емкостью 700 см, при 32 C. ,,а .Мелассный раствор приготавливали со" гласно технологической конструкции

ino производству пищевой лимонной кисл ja ноты(1970 r.) .

Опыты проводились на мелассе Ле" нинградского сахарного завода заготовки 1977 г. Меласса имела следующую характеристику: сахароза 483; зз

СаО 0,93; сухие вещества 75,23; доброкачественность 63,53;д 1,4 г/см рН 6 35.

В отличие от производственного культивирования, подращивание нлцелия проводили на мелассных средах, содерждцих 5Ф сахара, а брожение на

103-ных по сахару мелассных средах.

43 Состав сред для подращивания спор, r/ë:

Иеласса 104

Ферроцианид калия 0,25

Углекислый натрий

36 беэ водный О, 32

Г авелевокислый аммоний 2,01

Однозамещенный фос" фат калия 0,16

Сульфат цинка водный 0,005

Сульфат магния водный 0,25

Состав среды для брожения следующий, г/л:

Иеласса 208 ерроцианид калия 0,5 . Углекислый натрий, безводный

Одноэамещенный фосфат калия 0,16

Сульфат цинка водHHA 0,005

Для приготовления споровой суспензии 0,1 r cnop Aspergillus niger аамачивали в 10 мл 53-ного мелассного раствора в течение 1 ч при 32 С. Приготовленный 53-ный мелассный раствор для подращивания разливали в колбы по 50 мл и засевали 10 мл споровой суспензии. В этой среде споры подра" щивали 24 ч. Подрощенный мицелий служил посевным материалом для засева бродильных сред.

Бродильные мелассные среды с содержанием сахара 104 разливали в колбы по 50 мл и вносили в них по 10 мл подрощенного мицелия. Весь процесс брожения протекал на исходном бродильном растворе без дополнительных дробных доливов питательной среды и заканчивался через 5 сут (табл. 1).

Контролем служили варианты опытов, в которых процесс брожения осуществ" лялся в тех же условиях, но возбудителем брожения служил производствен" ный штамм Л-1 (табл. 1).

Испытания показали, что на мелассных средах с содержанием сахара 103, селекционированный штамм Л-4 увеличивает съем лимонной кислоты на 12,9t и дает экономию основного сырья мелас" сы на 11,43 по сравнение с исходным штаммом Л-l, культивируемым в тех же условиях.

Пример 2. Подращивание мицелия проводили на мелассных средах, содеращих 5Ô сахара, на брожение использовали мелассные среды с содержанием сахара 133.

Для подращивания использовалась

53-ная по сахару мелассная среда, иэприготовпенная согласно примера 1.

Для брожения приготавливали 133-ную по сахару мелассную среду, содержащую) г/л:

Меласса 270

Ферроцианид калия 0,65

Углекислый натрий безводный 0,65

975799 8 ма Л-1 - 9,8 r/ñè в сутки, у штамма

Л-4 - 11,96 г/см в сутки. Зкойомия основного сырья мелассы у штамма Л-4 составляет 9,17. .

Пример 4. Выращивание кисло" тообразующего мицвлия штамма Л-4 и синтез лимонной кислоты осуществляли глубинным способом на концентрированной среде в производственных усло- виях в цехе глубинной йермвнтации Ленинградского завода ho производству лимонной кислоты.

На замачивание конидий, подращиваwe посевного материала, ферментацию и на доливы использовали иелассный раствор, приготовленный из одной и той же мелассы с отработанным для нее режииом приготовления сред.

При ведении процесса с использова" нием штамма Л-4 на концентрированной сред» подращиввние осуществляли в

5 м» фвриентаторах в 3 мз иелассной средн с содержанием сахара 53. Через

24 ч подрощенный мицелий в объеив

3 м переводили в ферментатор брожения, содержащий 30 и® 103-ного по сахару мелассного раствора. В течение

3 сут объв. раствора поддерживали на уровне 32 и», подливая стерильную

30 воду. Через трое суток был начат подлив 253-ного мвлассного раствора.

Подлив проводили через 1,5 ч по

1000 л. С подливом внесено 1418 кг сахара. ювао При таком ведении процесса в составе синтезируемых кислот образова, лось 77,63 лиионной кислоты. Объем лимонной кислоты с 1 ма в сутки составил 9,31 кг, выход лимонной кисло в ты от сахара 71,1Ф.

Параллельно проводили контрольный цикл, в котором продуцентом являлся ,производственный штамм Л-1. При этом процесс лимоннокислого брожения осузз ществляли по известной технологииподращивание вели в 5 мВ йерментаторе на 34"ной по сахару мелассной среде в течение 24 ч, затем 3 мЗ подроценного мицелия переводили в фермента- вв тор брожения; содержащий 27 м 3;-ноо мелассного раствора. Через 24 ч ., рожения был начат подлив 253-ного по сахару нелассного раствора. Вводили по 1 и раствора через каждые

1,5 ч. С доливамы внесено 2642 кг сахара.,7

Однозаивщенный фосФат калия 0,16

Сульфат цинка водный 0,005

В остальном процесс проводили по технологии, описанной в прииере 1.

При ведении процесса брожения на

133-нои (по сахару) меласснои раст" воре (табл. 1) штамм Л"4 увеличивал съем лимонной кислоты на 17,73 и сни жал расход основного сырья мелассы йа 15 13, по сравнению со штампом

Л-1, культивируемом в тех we условия

П р и и е р 3. Процесс лиионнокислого брожения осуществляли в глу" бинных условиях (не по технологии, принятой в настоящее время на заводах по производству лимонной кисло" ты).

Для подращивания спор приготавли вали 33-ный по сахару мелассный раст . вор, содержащий, г/л:

Иеласса - 62

Ферроцианид калия 0,15

Углекислый натрий безводный 0,15

Г авелевокислый аммоний 1,2

Однозамещенный фосфат калия 0,16

Сульфат цинка водHHH 0,005

Сульфат магния водный 0,25

Для брожения приготавливали 34"ну по сахару бродильную среду (состав среды для подрагивания), но без добавления сульфата магния и щавелево" кислого аммония.

Состав среды для подлива, г/л: мвласса 521,0; ферроцианид калил

1 25.

Подращиванне мицелия вели в одну стадию на 33"ном (по сахару) мелас" снои растворе. На брожение приготав ливали 33-ный (no сахару) мелвссный раствор. Через 24 ч после засева бро дильных растворов подрощенным мицелиеи начинали дополнительные подливы иелассного раствора с содержанием:ое хара 2Я. Подливы проводили 2 раза 1 по 18,8 мп через 4 ч (табл. 2).

При ведении процесса на разбавлен

Ных мелассных средах у производствен

Ного штамиа Л"1 в составе синтезируеиых кислот лимонная кислота составляла 84,6, у нового штамма Л"490,23; съеи лнионной кислоты у штаиДлительность цикла составила

6,5 сут. При такои введении процесса

9 975799 10 с уеьвх кислот обра- У производственного штамма Р-1 иной кислоты. Съем аолучено 54,12 r лимонной кислоты

1 м в сутки со- в среднем на один стакан. Съем лимон . ход лимонной кисло- .- ной кислоты с 1 м в сутки составил и

1650 г, выход линонной кислоты от изво ственных сло- сахара 693.

330 в составе синтезир зовалось 80,3 лимо лимонной кислоты с ставил 8,64 кг, вы ты от сахара 78,93

Испытание в про д У виях показало, что штамм Л-4 является активным продуцвьтом лимонной кислоты на концентрированной мелассной среде, увеличивая съем лимонной кислоты на

9,2Ф по сравнению со штаммом Л-1, выращенным по заводской технологии.

Пример 5. Испытание проводили в лабораторных условиях поверхностным бессменным способом. lS

Собтав мвлассной среды следующий р г/л:

Свекловичная меласса (сахара в мелассе

47,73) 360,0 зз

Карбонат натрия безводного 0„8

6ерроцианид калия 0,81

Фосфат калия одноэаивщенный 0,11i

Сульфат цинка 0,005 рИ 7,18

Ивлассную среду в количестве 500 мл .,толщина слоя 12 см) наливали в химические стаканы с площадьв дна 30

0,41 дм . >(oíèäèè штамма Л-4 высевали на поверхность среды. Продолжи" тельность подращивания 8 сут, температура 32вС.

Параллельно выращивали производственный штамм Р-1 при оптимальном для него режиме. .Рецепт мвлассной среды для штамма Р-1 следующий, r/ë:

Свекловичная мвласса 49 (сахара в мелассе

47,7g)

Карбонат натрия безводный 09

Ферроцианид калия 1,3

Фосфат калия однозамещенный 0,»

Сульфат цинка 0,005 рП 7,2

По окончании опыта у штамма Л-4 эз получено 78,16 г лимонной кислоты в среднем на один стакан. Съем лимон» ной кислоты в пересчете на 1 м в

Ф сутки составил 2042 r, выход от са,хара 693.

Таким образом, предлагаемый штамм

Aspergil)us п1Пег Л-4 является высокоактивннм кислотообразователем flo сравнению с применяеиам производственным штаммом Jl-l, Р-1.и Л-106 при культивировании на средах из меласс глубинным и поверхностным способом.

В глубинных условиях на разбавленных мвлассных средах (по применяемой технологии) штамм Л-4 обеспечивает увеличение объема лимонной кислоты на

21,0 и экономию мелассы по сравнению со штаммом Л"1, примвняеи м в производстве по той же технологии на 18,13.

В глубинных условиях на концентри" рованных средах из мелассы, содержащей 9-133 сахара, штамм Л"4 обеспечивает увеличение объема лимонной кислоты по сравнению со штаммом Л-1, выращенным в тех жв условиях íà l2,9"17,73, а экономию мвлассы - на »,4-15,13, Кроме того, применение штамма Л-4 на концентрированных средах значительно снижает трудоемкость твхнологичес" кого процесса: сокращается число варок подливных мвлассовых растворов, требуются меньшие емкости для приготовления и хранения растворов; уменьшается вдвое количество подливов и необходимость проведения их в период, когда продуцвнт особенно подвержен ин4ицированию.

8 поверхностйых условиях культивирования на средах из мелассы, содержащей 15"173 сахара, штамм Л-4 увеличивает съем лимонной кислоты по сравнению со штаммами P-1 на 23,73.

Преимущество штамма Л-4 состоит и в том, что конидии этого штамма npo" растают через 7 ч, а у штаммов P-1 и

Л-106 - через 9-10 ч.

Применение нового штамма Л-4 дает воэможность перейти к сбраниванию мелассных сред с повышенным содержа" нием сахара в исходных растворах, используемых на брожение, что приведет к интенсификации лимоннокислого брожения глубинным способом.

1

I Y

I I1 X

I Cl

I =3 о

1 О. з tc

v 1O I

Е I I с

У3 9

1 1

3

I »

1 Е

»

1

I

I

1

1 !

1 !

I.

I !

1

1

1

1 t» I

X 1"

I Ф X о о у

I O.

1сх

:»» а

1 (Ч I

1

I !

1

I !

1

1

I

l и

Я о с а

Ф з

1»

»х о

I дФ О

Ю

С» Ъ

О1

OO

С7

ОЪ

CD

° -33

О 1

С2

+ с

+t- o

I Е

»х о

Ж о

X l

1 с

3О 1

I l

1

»Х

I О

1 3- X

I X е»

I Е X

I X

°

О 3.

Ф

Ct X о е

v о х о е

c o

1 т х,g о с х

3:»» и

° в

4 ) !

3 Ъ

СО

1 Е

I CL о

g u

Х У х о ъ» и

О З

X 3- Е

6О

Ю

1Ч

3«

Ю

3 »

9 с

Ф

tC»

L о

X с о о 5

ОЪ

° а

3М

С»

l

l !»1

I X I«

I Э X

I О

О Y

1 CL

t 3:= Y

t о

330

° 3

°

СР

CO л

1О

Ю фТ

Я

© о

Й

»х о х! !

I

I

f

I

1! I» и

1 ф о

У

Я It; с е

3 Е а

Ф

3X

X о

Ф

z о

I3

С.»

I а

Ф

I»

ОЪ

ln! X

1 С

33

C) f 6

1 Я

I

«»

О

О3

Ф

z

X о

Ф

Х

Ф

В о

1» о о

%

tt3 и о

1

I

3

3 !

1С

Х х

in

t Ф

z о

X Iz е

-Ф

СО

1

1

3.

3-. М о о

I" и (4В

СЪ

in о а т 3О

I о а ! о

Iи о

I »

О

К

X т

Э

I е а

3" е о

t33

1о

Ф

° g о

1 а с

L о

z

Ф х е о а о о х

С»

3««

1 е а

3v

g о

L о

X Й о х о о

3 Е

t33 1 а ом о а

iII lP

3 Х

os:х

Q. 5 36

3т

l3t

=Г х о

hC о а

X a т х

Ф е х о о с

»

С«

° 1 I I

I е I

I l

I х1

-1

С1

3О 3 е!

3 1

1

1

I

I

l

1 !

I

1

I

3

1

1

I

1 !

I

1 !

t

I

I

1

I

l

1

I

3

t

1- Y и

Ф»Х х о

x z

X о ох з

X I хз I

Ф 1

М» Q I

Iх о

1 63 I 1- I

О х а о 1

У

l l l

1 С L 1 о I

I I

I 2l I

3.Э 3С l

975799: о сп

° ь С

C3O С»

CX7 °

° in

»». (Ч сО

«ф О .

Ch е ф

О 4!

+ I 3» Ъ фЮ A а О

01 е Iz о! ее

1 « III 1

1 I

l

I I I

1 X х t o

I X 3 3

I Е 1

elRX

1 б I иеи

Хие

X Y С

»g o 7 охзе х х )- а са2СХо

ФЪ 1 1 е

X с

)о

l5

0 \

60 !

»»

1 1 дФ О 1

Ф 1 I 2

О х

1 =Г

Е I l5

CL I X

С«Ъ

Ю

1»»

I») Ф«Ъ

С«Ъ

)»» л

Ю

I

1 !

I

I

1 !

1

I !

1, I

1

1 I

1 Ъ«1 о

1 б е !

L х.Д сО

1 l

«х z р 3 9

I- X Е

)=, хо)-х

Ol

Ю

CO

С») 2

О х

I Я C с е

5 1 !

1 Сб

I Ф

p 63 к

1 Е.l5

Х! )5

Ф 1

0 о! сх

Ю

СО

Ю,о CO

1 Э

X 1y. u с о охе

ct и ав х с= )» =т

МЪ

Ю сО в 1

1 ЕЭ« еб- ае хэкИс

О х О кх оc

vü pev

:хм аах

I !

1 ! 1

I I

I O

1 ф

1 ! « 1 » Ф)

:! X

1 .1 и о

1з

1)б<1 Y

9 с х 0

1 P Cl

1 =Т ) о х а о

)сх

975799

1

1 ! !

I

1 !

Е I

x: чае! о е б М

RiX )

P Q Z 1

I в. ф

Л 1

1

Ctl I

М\ I

ОЪ I

С») 1

1!

1 ъО I

EA I

CV I

ОЪ I

1

С») I а

ОЪ I

O 1

° 1

1

° 0 1

-т в !

EFl 1

I

g« I ъО 1 с ) С« 1

) 1

CO 1 а

I!!

И\ I в О 1

° I!

) а

СО 1

Л I

I !!

1

СС\ б а ъО I

1

1

o !

1

) 1

С !

Источники информации, принятые во внимание hpH экспертизе!

5 975799

Формула изобретения 1. Авторское штамм гриба Asperg111us ntger Л-4- g 5ggg77 кл (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов Института 2. Авторское нВНИИГенетика", коллекционный номер s y 77а2 0

ЦМПМ F"171) - продуцент лимонной кис- 1979 роты.

3. Авторское и 407946, кл. С свидетельство СССР

12 P 7/40, 1975. свидетельство СССР

С 12 М 15/00, свидетельс1во СССР

12 И 1/14, 1972 °

Составитель M. Ларина

Редактор Н, Егорова Техреду А.Бабинец Корректор А» Грицен"о

Заказ о936/43 Тираж 505 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1130Яд Москва, И-Яд Раушская наб. 8. 4/$ филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная,