Питательная среда для выращивания туляремийного микроба

 

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА, содержащая 1 -аргинин НС1, 1-цистен НС1, 1-гистидин НС1, dl-изoлeйцин,l-лейцин , (й -лизин HCl, dl-метионин, 1-пролин , dl-треонин, 1-тирозин, Т-валин, , NaCl, MgSO,. , соль фосфорной кислоты, тиамин, глюкозу и дистиллированную йоду, отличают а я с я тем, что, с целью унифицирования среды, она дополнительно содержит пантотенат кальция, в качестве соли фосфорной кислоты она содержит при следующем количественном соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды: 1-Аргинин НС10,15-0,25 1-Цистеин НС11,3-1,7 1-Гистидин НС11,8-2,2 dl-Изолейцин0,12-0,17 0,35-0,5 1-Лейцин 0,35-0, 1-Лизин НС1 0,,55 d1-Метионин 0,9-1,1 1-Пролин i dl-Треонин 1.9-2,1 0,15-0,25 I-Тирозин 0,75-0,85 1-Валин 2,6-3,1 КНуРО. Natr 1,5-5,5 0,03-0,05 MgS04-7H,,0 1,5-1.8 Хиамин СО,О15-0,025 Пантотенат 0,04-0., 06 СО 4ib кальция :1A,0-16,0 Глюкоза

„„SU„;,1013470

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

: РЕСПУБЛИК з(Я)С 12 М 1 20

ГОЮУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОЧ КРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ й::;-.: (21) 3373500/28-13 (22) 29. 12. 81 (46) 23.04.83. Бюл. If 15 (72) В.Г.Майский, И.Н.Шишов и Ю.В.Сол" датова (71) Научно-исследовательский противочумный институт Кавказа и Закавказья (53) 576.8,093.1(088.8) (56) 1. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. Биргера И.О.

M., "Иедицина", 1973, с. 80.

2. Nagle S.Ñ., Anderson R.Е., La

ry й.0. Chemically difined medium

forthe growth. of Pasteurella tularenseI s. I. Bacteriology, 1960

voI 79, N 2, р. 566-571 (54) (57) flNTATEjlbHAR СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ТУЛЯРЕИИЙНОГО МИКРОБА, содержащая 1-аргинин НС1, 1-цистен НС1, 1-гистидин НСI, dl-изолейцин, 1-лейцин, Н-лизин HCl, dl-метионин, I-пролин, dl-треонин, l-тирозин, 1-валин, КН РО,, йаС1, HgS04 7Н О, соль фосфорнои кислоты, тиамин, глюкозу и дистиллированную воду, о т л и ч аю щ а я с я тем, что, с целью уни- . фицирования среды, она дополнительно содержит пантотенат кальция, в качестве соли фосфорной кислоты она содержит Ма НРО, при следующем количественном соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:

1-Аргинин НСI 0,15-0,25

1-Цистеин НС1 1 3-1 7

l-Гистидин НС1. 1,8-2,2

d1-Иэолейцин 0,12-0,17

1-Лейцин 0,35-0,45

1-Лизин НС1 0,35-0,45

dl-Иетионин 0,45-0,55

1-Пролин 0,9-1, 1

dl-Треонин .1,9-2,1

l-Тирозин 0,15-0,25

1-Валин - 0,75-0,85

КН,РО

Наь1 4,5-5,5

1gS0 7НКΠ— 0 03 0 05

Тиамин .9;015-0,025

Пантотенат кальция 0,04-0,06

Глюкоза ; 14,0-16, П

1013470

Целью изобретения является унифицирование среды °

Цель достигается тем, что пита- ЗО тельная. среда для выращивания туляремийного микроба, содержащая 1-аргинин

НС1, 1-цистеин HCl 1-гистидин НС1, d1 èçoëåéöèí, l-лейцин, 1 -лизин НС1, dl ìåòèîíèí, 1-пролин, dl-треонин, l-тирозин, l-валин, КН РО, NaC1, МфО ° Щ О, соль фосфорной кислоты, тиамйн, глюкозу и дистиллированную воду, дополнительно содержит пантотенат кальция, в качестве соли фос-40 форной кислоты она содержит Ма НРО при следующем количественном соотношении компонентов, г/л дистиллированной води:

1-Аргинин HCl 0,15-0,25

1-Цистеин HCl 1,3-1,7

1-Гистидин НС l 1,8"2,2

dl-Изолейцин 0,12-0,17

1-Лейцин 0 35-0,45

1-Лизин НС! 0,35-0,45

dl-Метионин 0,45-0,55

1-Пролин 09-11

dl-Треонин 1,9-2,1

1-Тирозин 0,15-0,25

1-Валин 0,75-0,85

КН,РО+ 2,6-3,1

NaCl 4,5-5,5

NgSO:7Н О 0,03-0,05

Nа2Н О„

1,5-1,8

Изобретение относится к микробио

:,! логии и касается синтетических пи" тательных сред для выращивания тупя" ремийного микроба.

Известна питательная среда для 5 выращивания туляремийного микроба кровяной глюкозо-цистиновый пи1ательный агар "Д" 1 ).

Однако на этой питательной среде не всегда возможно проводить мно. гие бактериологические, генетические и биохимические исследования туляремийного микроба, Наиболее близкой к изобретению является питательная среда для выращива 5 ния туляремийного микроба, содержащая

1-аргинин НС1, 1-цистеин НС1, l ãèñòè дин HCl dl èçoëåéöèí, l-лейцин, l лизин НС1, dl-метионин, l-пролин, dl""TðåîHèH, l-тирозин, l-валин, 20

КН2РО+, NaC1, МАЗО„ ° 7Н, О, соль Фосфорной кислоты, тиамин, глюкозу и дистиллированную воду (2 ), Однако на известной питательной среде невозможно получить рост широ" 25 кого круга туляремийных микробов.

Тиамин 0,015-0,025

Пантотенат кальция 0,04-0,06

Глюкоза 14,0- 16,0

Готовят питательную среду следу-, ющим образом, П р и.м е р 1. Берут 1,5 г двузамещенного фосфорнокислого натрия (14а НРО4) и в него заливают 375 мл дистиллированной воды. Эту смесь подогревают на водяной бане до 90 С и перемешивают до полного растворения. Затем 2,6 г однозамещенного фосфорнокислого калия (КН РО ) заливают 625 мл дистиллированной воды, эту смесь подогревают на водяной бане до 70ОС и перемешивают до полного растворения. Затем растворы фосфорнокислых солей объединяют, добавляя к натриевой соли соль калия, при этом образуется калиеВо íàòðèåâûé фосфатный буфер, рН -6,6, который является основой для получения жидкой питательной. синтетической среды. Для получения плотной синтетической питательной среды в калиево-натриевый фосфатный буфер добавляют 10-15 г/л агар-агара.

Агар-агар вносят в полученный калиево-натриевый фосфатный буфер и расплавляют его на кипящей водяной бане (100оС) в течение 20 мин.

Затем отвешивают аминокислоты, г:

l-Аргинин НС1 0,15

1-Цистеин НС8 1 3

1-Гистидин 1,8

di-Изолейцин 0,24

1-Лейцин 0,35

1-Лизин НС1 0 35

dl-Метионин 0,9

:1-Пролин 0 9

dl""Òðåîíèí 3,8

1"Валин 0»75

Каждую из навесок аминокислот растворяют поочередно в 10 мл приготовленного ранее калиево-натриевого фосфатного буфера, нагревают до 90оС с помешиванием до полного растворения, сливают в одну емкость объемом более 1 л и перемешивают.

Затем к 0,15 г 1-тирозина добавляют 2 мл 1 н. едкого натра (МаОН), после этого к навеске 1-тиродина с 1 н. едким натром добавляют 40 мл приготовленного ранее фосфатного буфера, нагревают до 90 С при помешивании и сразу же после его раст3 10134 ворения сливают в емкость со смесью аминокислот.

Потом растворяют 4,5 г хлористо, го натрия (NaC1) в 20 мл фосфатного буфера при нагревании до 70 С и помешивании; затем 0,03 г сернокислого магния (HgS0+), 0,015 г тиамина, 0,04 г пантотената кальция - каждую из навесок растворяют в 2 мл дистиллированной воды при нагревании до р

70 С и помешивании. Растворенные о компоненты добавляют поочередно с помешиванием к смеси растворов аминокислот.

После этого объем среды доводят до 1 л приготовленным ранее фосфатным буфером и стерилиэуют в автоклаве в течение 30 мин при 0,5 атм. Затем готовят 354-ннй раствор глюкозы.

Для этого берут 14,0 г глюкозы, ра- 2О створяют в 40 мл дистиллированной воды и стерилизуют в автоклаве при ° режиме 1 атм в течение 5 мин.

Пример 2. Берут 1 8 г двузамещенного фосфорнокислого натрия (йа2НР04), заливают 375 мл дистиллированной воды и эту смесь подогревают на водяной бане до 90оС и перемеши.вают до полного растворения. Затем

3,1 г однозамещенного фосфорнокислого калия (КН РО ) заливают 625 мл дистиллированнои воды, эту смесь подогревают на водяной бане до 70 С и перемешивают до полного растворения. Затем растворы фосфорнокислых солей объединяют, образуя калиево-нат- риевый фосфатньтй буфер, рН -6,6. Для получения плотной синтетической среды применяют агар-агары. Агар-агары вно- . сят в полученный калиево-натриевый фосфатный буфер рН-6,6 и расплавляют на кипящей водяной бане (100 C ) в течение 20 мин. Затем отвешивают аминокислоты, г:

l-Аргинин НС1 0,25

1-Цистеин HCl 197

1-Гистидин 2,2

dl-Изолейцин 0,34

l-Лейцин 0,45

1-Лизин HCl 0,45

dl-Иетионин 1,1

l -Пролин 1,1

dl-Треонин 4,2

l-Валин 0,85

Каждую из навесок аминокислот растворяют в 40.мл приготовленного ранее калиево-натриевого фосфатного буфера при нагревании до 90 С с помешиванием до полного растворения и

70 4 сливают в одну ем кос т ь объемом более 1 л.

Затем к 0,25 г 1-тирозина добавляют 2 мл 1 н, едкого натра, после этого к навеске l-тироэина с I н. едким натрием добавляют 40 мл приго" товленного ранее фосфатного буфера, нагревают до 90 С при помешивании и сразу же после его растворения сливают в емкость со смесью аминокислот. Потом растворяют 5,5 г хлористого натрия в 20 мл фосфатного буфера при нагревании до 70 С и помешивании, затем отвешивают 0,05 r сер" нокислого магния (И9ЬО ) 0,025 г тиамина, 0,06 r пантотената калиякаждый растворяют в 2 мл дистиллированной воды при нагревании до 70 С и помешивании, Растворенные компоненты добавляют поочередно с помешиванием к смеси растворов аминокислот.

После этого объем среды доводят до 1 л приготовленным ранее фосфатным буфером и стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 0,5 атм (110,8 С). Затем готовят 40 -ный раствор глюкозы. Для этого 16,0 г глюкозы растворяют в 40 мл дистил-, лированной воды и стерилиэуют в автоклаве в течение 5 мин при 1 атм.

Стерилизованную питательную сре" ду и раствор глюкозы хранят раздель но в холодильнике при 3-6 С до исполь" о зования.. Срок хранения.до 60 сут.

Предлагаемую питательную среду используют следующим образом.

Перед посевом берут жидкую среду и в нее вносят 40 мл приготовленного

35 или 403-ного раствора глюкозы, в зависимости от концентрации компонентов по граничным пределам.. Затем разлива чт во флаконы или колбы по 1050 мл. B отличие от известной жидкой питательной среды выращивание на предлагаемой жидкой среде проводят без принудительной аэрации.

Если посевы проводить на плотную питательную среду, то ее предварительно расплавляют на водяной бане, затем в нее вносят 40 мл 35-404-ного раствора глюкозы и перемешивают. После этого среду разливают в пробирки по 5 мл и скашивают или в чашки Петри по 25"

30 мл. Посев производят на застывшие агаровые поверхности, Плотная среда прозрачная, что позволяет четко наблюдать йорфологию колонии.

Предложенная питательная среда, позволяет обеспечить стабильный и до.

5 1013470 6 статочный рост туляремийного микроба новидности этого возбудителя - голарк(2-3 ° 10 м к/мл среды ) по оптическо- тическую, неарктическую и среднеазиму стандарту мутности ТИСХ (кишечному) атскую расы.

Выход бакгерий на жидкой среде полу- Рост веех рас туляремийного микрочают на 3 порядка выше посевной дозы, у ба на предлагаемой среде позволяет а также-получают и сплошной рост на изучать его свойства на более высоком плотной среде. уровне, а именно таких как особенноПредлагаемая питательная среда сти неготипа, путей метаболизма, акобеспечивает достаточный рост иссле- тивности ряда ферментов, знание этих дованных штампов туяяремийного микро- В свойств имеет практическое значение ба, представляющих все известные раз- для борьбы с этой инфекцией.

Составитель С.Малютина

Редактор О.Половка Техред О.Неце Корректор М.Демчик

Заказ 2942/34 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, 1-35., Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4