Способ получения капсульного антигена

 

Способ получения капсульного антигена, включающий обработку водного экстракта взвеси капсульных бактерий, элюцию, диализ и лиофилизацию целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта и упрощения способа, водные экстракты обрабатывают хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты при массовом соотношении сухого водного экстракта и хлорангидрида 1 : 5 - 10 при 0 - 20^oС, затем полученный ацилированный антиген подвергают сополимеризации с гидрофильным мономером в соотношении 1 : 5 - 10 в присутствии 0,5 - 2,0 мас.ч. бифункционального мономера-сшивателя и целевой продукт элюируют из измельченного геля.

Изобретение относится к иммунологии. Известен способ получения капсульного антигена, заключающийся в том, что исходный экстракт осаждают 70%-ным этанолом при 4^oC, оставляют на 20 ч, затем центрифугируют, осадок растворяют в деионизированной воде и ступенчато хроматографируют на колонках с диэтиламиноэтилцеллюлозой, целевой продукт преципитируют этанолом и гомогенизируют хлороформом и трет-бутанолом [1] Известен также способ получения капсульного антигена, включающий обработку водного экстракта взвеси капсульных бактерий (концентрирование, добавление 0,4 н. NaCl, хроматографирование, элюцию, диализ и лиофилизацию целевого продукта [2] Однако известные способы не обеспечивают высокой чистоты целевого продукта, так как присутствуют примеси 0-антигена, трудоемки и многостадийны. Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта и упрощение способа. Цель достигается тем, что в способе получения капсульного антигена, включающем обработку водного экстракта взвеси капсульных бактерий, элюцию, диализ и лиофилизацию целевого продукта, отличием является то, что водные экстракты обрабатывают хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты при весовом соотношении сухого водного экстракта и хлорангидрида 1 5-10 при температуре от 0 до 20^oC, затем полученный ацилированный антиген подвергают сополимеризации с гидрофильным мономером в соотношении 1 5-10 в присутствии 0,5-2,0 мас. ч. бифункционального мономера-сшивателя и целевой продукт элюируют из измельченного геля. Пример. 10 г высушенных ацетоном капсульных бактерий Е.col. K 100 суспендируют в 100 мл дистиллированной воды во фланцах со стеклянными бусами, встряхивают на шуттель-аппарате в течение 1 ч. Суспензию центрифугируют в течение 50 мин при 5 тыс. об/мин и собирают надосадочную жидкость. Осадок ресуспендируют аналогичным образом. Обе порции надосадочной жидкости объединяют, диализуют против водопроводной и дистиллированной воды и лиофилизируют. Выход антигенного комплекса составляет 20% от исходного веса лиофилизированных микробных клеток. 0,3 г антигенного комплекса растворяют в 10 мл дистиллированной воды, охлаждают до 0^oC и в течение получаса по каплям вводят 1,5 г хлорангидрида акриловой кислоты. Раствор доводят до комнатной температуры, добавляют 1,5 г акриламида и 0,15 г N,N-метиленбисакриламида и продувают аргоном в течение 10-15 мин, полимеризуют в присутствии персульфата аммония и N,N,N,N -тетраметилэтилендиамина в течение 1 ч. Полученный гель измельчают на нейлоновых ситах, заливают 50 мл дистиллированной воды, шуттелируют 20 мин и фильтруют через фильтровальную бумагу на воронке Бюхнера. Элюат диализуют против проточной воды в течение трех суток и против сменяемой не менее трех раз дистиллированной воды в течение суток и лиофильно высушивают. Выход целевого продукта составляет 39-66% от взятого в опыт количества водного экстракта. Иммунохимическую специфичность и антигенную активность препарата определяют в реакции преципитации в геле, в опытах иммуноэлектрофореза и встречного иммуноэлектрофореза, а также в реакциях непрямой гемагглютинации (РНГА) и торможения непрямой генагглютинации (РТНГА). Водный экстракт и целовой продукт исследуют в параллельных опытах. Как видно из таблицы, в опытах иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза в целевом продукте, в отличие от водного экстракта, не выявлялись фракции, соответствующие О-антигену. При иммуноэлектрофорезе целевой продукт не образовывал преципитатов с О-сывороткой и образовывал одну зону преципитации в сторону анода с К-сывороткой. В опытах встречного иммуноэлектрофореза оптимальная доза в опытах с К-сыворотками у целевого продукта составляла 20 мкг, а у водного экстракта 64 мкг. Целевой продукт (К-антиген), в отличие от водного экстракта, не обуславливает преципитатов в опытах встречного иммуноэлектрофореза с О-сыворотками. Целевой продукт в отличие от водного экстракта не сенсибилизирует формалинизированные тонизированные эритроциты барана. В опытах торможения непрямой гемагглютинации минимальная тормозящая доза для целевого продукта превышает 1 мг/мл, а для водного экстракта она составляет 0,015 мг/мл в опытах с К-сывороткой и 0,03 мг/мл в опытах с О-сывороткой. Аналогичным способом получают К-антигены из H.influenzae типа b, Bu-антигены из S. typhi. Антигены по иммунохимической характеристике и биологической активности не отличались от К-антигенов, полученных более сложными способами. Предлагаемый способ позволяет получать капсульные антигены полисахаридной природы, не содержащие примеси 0-антигена, более простым способом из различных видов капсульных микроорганизмов.

Формула изобретения

Способ получения капсульного антигена, включающий обработку водного экстракта взвеси капсульных бактерий, элюцию, диализ и лиофилизацию целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта и упрощения способа, водные экстракты обрабатывают хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты при массовом соотношении сухого водного экстракта и хлорангидрида 1 5 10 при 0 20^oС, затем полученный ацилированный антиген подвергают сополимеризации с гидрофильным мономером в соотношении 1 5 10 в присутствии 0,5 2,0 мас.ч. бифункционального мономера-сшивателя и целевой продукт элюируют из измельченного геля.

РИСУНКИ

Рисунок 1