Способ получения регулятора автолиза микроорганизмов

 

„SU„„1025724

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

А, g g С 12 N 1/06

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (53) 663..18 (088.8) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3389638/28- 13 (22) 01. 02.82 . (46) 30.06.83. Бюл. 11 24. (72) К А. Калунянц,. Т.А. Кузнецова и О.В. Кислухина (71) Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (563 1. Cleveland R.F., ЖсКеп A.У

Daneo-Moore L., Shockman Y.D. Inhibi-.

tion .of wall autolysis in streptococcus faeca1is by lipoteichoic acid

and. liPida.- "J.Bacterid", 1976, 126, N l, р, 192.

2. Авторское свидетельство СССР

11 759526, кл. С 076 7/02, 1978. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГУЛЯТОРА

АВТОЛИЗА. МИКРООРГАНИЗМОВ, предусматривающий их лизис, отделение осадка клеток и обработку лизата органическими растворителями, о т л ич а ю щ и.й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта удешевления способа, а также расширеHHR спектра действия регулятора, из микроорганизмов используют избыточные дрожжи пивоваренного производства Saccharomyces cerevisiae 1I, лиэис осуществляют путем автолиэа дрожжей при 28-32оС в течение 4-6,ч, после обработки лизата органическими растворителями образовавшуюся твер-, Я дую фазу удаляют, а из жидкой фазы выделяют регулятбр автолиза.

С:

Ф

10257

Изобретение относится к микробиологической и пищевой промышленности и ветиринарии, в частности к способам получения регулятора автолиза микроорганизмов. 5

Известен способ получения регулятора автолиза микроорганизмов путем экстракции из бактериальных клеток липотейхоевых кислот фенолом, хлор-( формом и фракционирования их на сефа- >0 розе и биогеле (11 .

Недостатками этого способа являются сложность и высокая стоимость регулятора.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения регулятора автолиза микроорганизмов, предусматривающий их лизис, отделение осадка клеток и обработку лизата органическими растворителями, Регулятор выделяют из ферментолизата биомассы бактерий путем экстракции 5- 1ОФ-ной трихлоруксусной кислотой с последующим осаждением из экстракта 5-6 объемами органичес: ких растворителей. Ферментативному лизису подвергают суспензии биомассы с концентрацией сухих веществ 5-203.

Для лизиса используют на первой ста30 дии литической фермент, на второй— протеолитический, например яичнйй лизоцим и трипсин в концентрации

0,1 мг/мл.

Для различных видов бактерий рода

BBcl1111s для метаноокисляющих бакте35 рий Р 170 и E. coli К 12 выход регулятора составляет 5- 103 к сухому весу биомассы (2) .

Недостатками известного способа ч 40 являются ограниченныи спектр деиствия регулятора автолиза, низкий выход и высокая себестоимость. целевого продукта, а также необходимость использования кислотоупорного оборудования на стадиях экстракции регулятора

45 трихлоруксусной кислотой, отделения экстракта от биомассы и осаждения регулятора из экстракта органическими растворителями.

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта, удешевление способа, а также расширение спек- тра действия регулятора.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения регулятора автолиза микроорганизмов, предусматривающему их лизис, 24

2 отделение осадка клеток и обработку лизата органическими растворителями, из микроорганизмов используют избыточные дрожжи пивоваренного производства Saccharomyces cerevisiae il, лизис осуществляют путем автолиза дрожжей при 28-32 С в течение 4-6 ч, после обработки лизата органическими растворителями образовавшуюся твердую фазу удаляют, а из жидкой фазы. выделяют регулятор автолиза.

Способ получения регулятора автолиза микроорганизмов заключается в следующем.

Избыточные дрожжи пивоваренного производства со стандартным для данного продукта содержанием сухих веществ (7-9/) подвергают автолизу при 28-32 С в течение 4-6 ч при постоянном перемешивании. По окончании процесса автолиза жидкую фазу автолиза отделяют центрифугированием, осадок отбрасывают, а к центрифугату приливают при перемешивании 4,5-5,5 объемов органического растворителя (ацетона, изопропанола, этанола), Выпавший осадок отделяют и отбрасывают, а надосадочную жидкость, содержащую регулятор автолиза, упаривают или обрабатывают иным способом с целью удаления органического раствори- теля. Полученный после удаления растворителя водный раствор регулятора автолиза используют в жидком виде или высушивают. В первом случае предварительно. определяют содержание сухих веществ в растворе и дозируют препарат в пересчете на сухое вещество.

Получаемый регулятор может быть использован как для повышения, так и для снижения интенсивности автолиза клеток бактерий, дрожжей и грибов. .Направленность и сила воздействия регулятора зависят от субстрата (автолизирующегося микроорганизма).

Результаты влияния регулятора на интенсивность автолиза микроорганизмов приведены в таблице, Пример 1,10 л избыточных, дрожжей с содержанием сухих веществ

73 подвергают автолизу в течение

4 ч при 32 С при постоянном перемешивании, после чего жидкую фазу автолизата отделяют центрифугированием, осадок отбрасывают. Объем центрифугата 8,2 л. Центрифугат охлаждают о до 5 C и при перемешивании приливают

1025724 100

Вариант

Микроорганизмы без регулятора (контроль) с регулятором

7, 8

Lact. p1antarum 8РА3

Е.coli М17

6,9

5,0

45,1 л холодного иэопропанола. Выпавший осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают, а из фугата удаляют изопропанол отгонкой на водяной бане. Полученный после отгонки иэопропанола водный раствор регулятора автолиза лиофилизируют. Выход препарата 151,2 r или 21,6i к весу сухой биомассы избыточных дрожжей.

Для определения действия регуля- >0 тора на автолиз микроорганизмов приготавливают водные суспензии их биомассы со стандартной оптической плотностью 0,95-1,05 при измерении на

ФЭК-56 М и при длине волны 540 нм в 15 кювете толщиной 5 мм. Затем состав.-. ляют реакционные смеси из равных объемов стандартной суспенэии и водного раствора регулятора концентрации 2 мг/мл (конечная концентрация 20 регулятора в реакционной смеси

1 мг/мл). В контрольном опыте к стандартной суспензии приливают равный объем воды. Измеряют исходную оптическую плотность реакционной смеси 25 (3) ) и оптическую плотность после инкубации в течение 1 ч при 37а(3,).

Вычисляют интенсивность автолиза Я

1= о

Полученные результаты приведены в таблице, варианты 1 - 9, Из данных таблицы следует, что добавление Регулятора е вариантах 35

1-3 приводит к полному торможению автолиза, в вариантах 4 - 6 интенсивность автолиза снижается в 1,810,4 раза, а в вариантах 7-9 повышается в 2,9-3,1 раза.

П риме р 2 . 2 л избыточных пивных дрожжей с содержанием сухих веществ 93 подвергают автолизу в течение 6 ч при 28 С и постоянном .перемешивании, затем жидкую Фазу ав- 45

Asp. foeti6us ГП1020 толизата отделяют центрифугированием и охлаждали. до 3 С. Объем центрифу гата 1,56 л. К цен1рифугату приливают при перемешивании 7 л холодного аце., тона, Выпавший осадок отделяют цент. рифугированием и отбрасывают, а иэ центрифугата удаляют ацетон отгонкой

:на водяной бане. Полученный после от гонки ацетона водный раствор регулятора автолиэа содержит 3,643 сухих веществ, объем раствора 1 л. Выход препарата 36,4 г или 20,24 к весу сухой биомассы избыточных дрожжей.

Действие полученного жидкого препарата на автолиэ микроорганизмов определяют так же, как в примере предварительно приготовив раствор регулятора с концентрацией сухих веществ 2 мг/мл.

Полученные результаты приведены в таблице, варианты 10-14.

Регулятор вызывает полное подавление автолиза в вариантах 10 и ll, в вариантах 12-14 интенсивность автолиза повышается в 1,46- 12,3 раза.

Таким образом, предлагаемый способ получения регулятора автолиза по сравнению с известным позволяет получать препарат, с помощью кото t рого можно как повышать, так и понижать интенсивность автолиза в зависимоати от таксономической принадлеж. ности микроорганизма. Кроме того, регулятор автолиза может быть использован для воздействия не только на бактерии, но также на дрожжи и грибы, что расширяет сферу его применения.

Предлагаемый способ обеспечивает выход регулятора около 20>, что значительно превышает выход по известному способу (5-10 ); Себестоимость препарата понижается в 3,7-7,4 раза.

Интенсивность автолиза, 1025724

Продолжение таблицы

««««««е««е««

Интенсивность анализа, Микроорганизмы

Вариант

27,1

2,6

Lact. fermenti 90ТС4

5 3

12,2

Е. coli MRE-600

93

17,t

Rhodotorula aurant iaca

Метаноокисляющие бактерии Р 170

9i5

29,0

Saccharomyces cerevisiae 12

4,S

2,4

6 9

4,9

7,0

B.subfilis R2,10,2

Метаноокисляющие бактерии У 170

9,0

27,0

8,0

0,65

Saccharomyces vini 21

Составитель В. Голимбет

Редактор А: Огар Техред Т.Маточка: Корректор О. Билак

Заказ 4497/20 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам. изобретений и открытий

113035., Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4 /5 филиал RHfl "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Saccharomyces vini

Е.coli М17

Asp.foåtiduaÃÏ1020 без регулятора с регулятором контроль