Аналог энкефалина,обладающий анальгетическим действием
Аналог энкафалина Tyr-D Arg-Gly-Phe NH , обладающий анальгетическим действием . i he-NH-i Gly
((9) (!)) СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н АВТОРСКОМУ СВИДЕ"П=ЛЬСТБУ
Tyr-D Ar g-(1у-Phe NH» -ннг нн, ннг
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР е AO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3347648/23-04 (22) 16.10.81 (46) 30.03.85. Бюл. Ф 12 (72) И.В. Боброва, Г.И. Чипенс, В.E. Клуша и Н.А. Абиссова (71) Ордена Трудового Красного Знамени институт органического синтеза
АН Латвийской ССР (53) 547.964.4.07(088.8) 4(51) С 07 С 5/1О А 61 К 37/02 (54) .АНАЛОГ ЭНКЕФАЛИНА, ОБЛАДАЮЩИЙ
АНАЛЬГЕТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ, (57) Аналог энкефалина формулы обладающий анальгетическим действием.
1048703
1
Изобретение относится к новому биологически актинному соединению аналогу энкефалина, обладающему анальгетическим действием, которое может найти применение в медицине. ,Природные энкефалины †метионин и лейцин Н Tyr-СХУ-Gly-Phe ОН и
Н Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu ОН, соответственно проявляют морфиноподобную активность в опытах на специфических моделях оциатного рецептора и подавляют стереоспецифическое связывание с рецептором опиатного антагониста налоксона в гомогенатах мозга. 15
Однако эти энкефалины проявляют слабую и кратковременную (5-15 мин) аиальгезию при внутрижелудочковом введении в мозг мыши и не активны при внутривенном перроральном и дру- 20 гих способах введения.
Наиболее близким структурным аналогом описываемого соединения .является (D-Arg ) — лейцин.энкефалин, обладающий анальгетической актив- 25 ностью при внутримозговом введении.
При внутривенном введении этот аналог анальгезией ие обладает, Цель изобретения — расширение арсенала средств воздействия на жи- gg вой организм, обладающих анальгетическим действием, Цель достигается предлагаемым аналогом энкефалина формулы
Н Tyr-D Arg-Gly-Phe НН обладающим анальгетическим действием..
Описываемое соединение. — (D-Arg дез-Leu ) - знкефалинамид синтезиро- 4О
1 ван с использованием известных методов пептидной химии по схеме с использованием в качестве конденсирующего агента дициклогексилкарбодиимида, а также пентафторфениловых эфиров трет-бутилоксикарбониламинокислот. Гуанйдииовая функция В-аргинина была защищена нитрогруппой, гидроксил тирозииа — бенэильным радикалом.
Карбоксильную группу глицина защища- у ли этерификацией. Вос-группы в синтезе пелтида удаляли 50Х-ным раствором трифторуксусной кислоты (TFA) в хлористом метилеие. Нитро- и бензиль-. ную защиты снимали каталитическим гидрогенолизом.
-Общая схема синтеза приведена на чертеже °
Для синтеза (В-Аг8 дез-Lei. энкефалннамида используют аминокислоты и их производные фирмы "Reanal".
Все аминокислоты, кроме D-аргинина имеют L-конфигурацию. Температуру плавления веществ определяют в капилляре (без коррекции). Индивидуальность промежуточных соединений контФ ролируют с помощью ТСХ на пластинках
"S11ufol" (ЧССР) в следующих системах растворителей: хлороформ - этанол— уксусная кислота (АсОН), 85:10:5 (А), н. бутанол — пиридин — АсОН вЂ” Н О, 15: 10:3:б (В), н. бутанол — АсОЙ—
- Н,О, 4: 1:1 (С). Аналог энкефалина хроматографируют на пластинках фирмы
"Meric" в системах: хлороформ - метанол — АсОН - Н О, 30:20:4:6 (D), н. бутанол — пиридин — АсОН вЂ” Н,О, 15: 12:3: 10 {Е). Удельное,, оптическое вращение пептидов измеряют на поляриметре "Perkin - Elmer " 141 М" (США).
Кислотный гидролиз проводят в запаянных ампулах в 6 н.соляной кислоте при 120 С в течение 24 ч. Аминокислотный состав определяют на анализаторе "Jeol-3". Для всех соединений данные элементного анализа удовлетворительно совпадают с вычисленным содержанием С. Н, N..
Этиловый эфир N -трет-бутилоксикарбонил-М -нитро-9-аргинил-глициЯ на (1). К раствору 6,38 .г (20 ммоль)
N -трет-бутилоксикарбонил-Б -иитроc4
D-аргинина и 3,24 г (24 ммоль) 1оксибенэотриазола в 20 мл дииетйлформамида (ДИФА) при охлаждении до
-15ОC прибавляют 4,12 г (20 ммоль) дициклогексилкарбодиюйща {ДСС) .в
8 мл ДМФА, перемешивают 3 ч при 0 С, о затем добавляют 3,07 r (22 ммоль) этилового глицина гндрохлорида, 3,08 мл (22 ммоль) триэтиламина и перемешивают 24 ч при 20.С. Реакционную массу разбавляют этилацетатом и водой (до разделения слоев).
Этилацетатный слой отделяют и промывают последовательно 5Х-ным раствором КНЯО, 5Х-ным раствором NaHCO, водой, насйщенныи раствором NaCl ° сушат над безводным Na Q о 119 С (размягчается при 96 С), (0 32 13,5 (C t 4 ДИФА) 3 R4=0 68 (В) . 1048703 Этиловый эфир N-трет-бутилоксикарбонил-о-бензил-L-тирозил-N -нитG ро-D-аргинил-глицина. 4,04 r (10 ммоль) дипептида (1) растворяют в 15 мл 50%-ного раствора TFA в дихлорметане и выдерживают- 30 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над КОН. Получают 4,01 r (96 ) трифторацетата (11), R<=0,48 (В). fO 2 r (5 ммоль) трифторацетата.(II) растворяют в 10 мл ДИФА, охлаждают до -5ОС,и при перемешивании добавляют 0,6 мл (5 ммоль) триэтиламина в 2 мл ДИФА и 2,46 г (5 ммоль) н-нитро- f5 фенилового эфира N-трет-бутилоксикарбонил-о-бензил-L-тирозина, растворенного в 10 мл ДИФА. Смесь выдерживают 1 ч при .-5 С, 24 ч при 0 С и еще 24 ч при комнатной температу- 20 ре. Затем реакционную массу выливают в 500 мл воды со льдом, выделившееся в осадок вещество отфильтровывают. Осадок растворяют в этилацетате и промывают. 5 -ным раствором KHSO>, 25 водой, 5 ;ным раствором КНСО, водой., насыщенным раствором NaCl и высушивают над безводным Na БО4.. Растворитель отгоняют, продукт этиловый эфир Н-бутилоксикарбонил-о-бензил-L- . 30 тирозил-N -.нитро-D-аргинил-глицина (ХХХ) перекристаллизовывают из этилацетата. Выкод f,77 r (54 ) трипептида (ХХХ), т.пл. 162-164 С, (ю() +11,1 (с 1, ДИФА); К =0,65 (А). Я-трет-бутилоксикарбонил-о-бензилL-тирозил-Н -нитро-D-аргинил-гли.ции (IV) . 9,66 г (1 ммоль) трипептида (III) растворяют s 15 мл метанола,40 прибавляют 1 н. раствор ИаОН до рН 10-11 и выдержйвают несколько мииут до окончания гидролиза (хроматографический контроль). Отгоняют растворитель, добавляют воды и под-. кисляют 1 и. HCl до рН 3. Выпавший осадок отфильтровывают и хроматографируют на колонке с силикагелем в системе хлороформ-этанол-этилацетатАеОН-Н,О, .85:5:8:2:0,25. Получают 0,34 r (54 ) туипептида (Х7), т.пл. 86 С,Ы1 +5,5 (с. 1, ДИФА); К =0,60 (С}. Б-трет-бутилоксикарбонил-о-бензюг L-тирозил-N â€,нитро-Р-аргинил- глицил- Ь-фенилаланинамид. 3,15 г (5 ммоль) трипептида (IV) растворяют в 10 мл о этилацетата, охлаждают до 0 С и при перемешивании добавляют 1,01 г (5,5 ммоль) пентафторфенола и 1,13 г (5,5 ммоль) ДСС, растворенных в этилацетате. Через 2 ч смесь о охлаждают до -10 С, выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают, растворитель отгоняют, маслообразный остаток растирают с гексаном до затвердения. Получают 3 54 г пентафторфенилового эфира (U); R =0,90 (С). 0,89 r (4,45 ммоль) гидрохлорида L-фенилаланинамида (V1) растворяют в 6 мл ДИФА и при перемешивании ! добавляют 0,62 мл.(4,45 ммоль) триэтиламина в 2 мл ДИФА и 3,54 r (4,45 ммоль) пентафторфенилового эфира (V), растворенного в 4 мл ДМФА. Реакционную массу перемешивают несколько часов, ДМФА отгоняют при о 40 С, остаток растворяют в этилацетате и обрабатывают аналогично соединению (III). Продукт N -трет-бутил-, оксикарбонил-о-бензил-Ь-тирозил-Nqнитро-D-аргинил-глицил-L-фенилаланинамид (VII), полученный после отгонки растворителя, растирают с теплым этилацетатом, отфильтровывают и сушат в вакуум-эксикаторе. Выход 1„44 r (42 ) защищенного амида тетрапептида (VII) т.пл. 173175 С,Я вЂ” 6,3 (с.1, ДИФА), К =0,43 (А), Rg=0,74 (В) ° L-тирозил-D-аргинил-глицил-L-фенилаланинамид. 0,5 г (0,64 ммоль) тетрапептида (VII) растворяют в 7 мл 50 -ного раствора TFA в дихлорметане и выдерживают в течение 30 мин. Раствор ( упаривают, остаток растирают с эфиром, сушат в вакуум-эксикаторе над К0Н. Получают 0,46 г трифторацетата (VIII) R(=0,85 (Д). К раствору 0,46 r (0,58 ммоль) соединения (VIII) в 5 мл метанола до. бавляют палладиевую чернь, 0,2 мл уксусной кислоты и гидрируют 6 ч а при 20 С. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром на фильтре, сушат над КОН L-тирозил-D-аргинилглицил-2-фенилаланин (IX) в вакууме. Полученный продукт (О, 42 г) очищают на КИ-целлюлозе. Соответствующую фракцию собирают и лиофилизуют. Выход 0,20 r (57 ) амида тетрапептида энкефллина (IX),th),а +23,7 (с 1, метанол),(gJ> +43,3 (с,1, В . 1048703 Ь О, 2 н АсОН); Ri =О, 75 (Д}, Ri =О, 62 (Е) аминокислотный состав: Туг 0,87; Phe 1,04; G1y 1,00; Arg 0,97. Биологическая активность (D-Arg дез-Leu }-энкефалинамида исследована в опытах in vivo. В работе использованы беспорбдные мьппи-самцы массой 20 г. Описываемое вещество, растворенное в стерильном физиоло-10 гическом растворе, вводят при помощи I-образной иглы в cisterna magna мозга неаиестезированньм мьппам в количестве 10 мкл. Исследован диапазон доз: 1,0 — 100,0 мкг/жив. Конт15 рольным животным вводят 10 мкл стерильного физиологического раствора. -.. Каждая экспериментальная группа состоит из 10 мьппей. Анальгетический . эффект соединения оценивают по тесту "tai1 рь.псЬ при помощи артериальи 20 ного зажима, который накладывают на основание хвоста. Определение болевой реакции проводят через 5, 15, 30, 60,90 мин после введения и затем каждые 30 мин до исчезновения анальгетической реакции. Результаты выражают альтернативным методом в проценте мьппей, показавших анальгети- ческую реакцию. При вычислении ЕД (эффективная доза исследуемого вещества, которая вызывает анальгетический эффект у 50Х подопытных животных) иснользуют метод Литчфилда и Уилкоксоиа. Анальгетическая активность исследованных соединений приве-3s дени в табл. 1. (9"Arg, дез-Leu )-энкефалинамид проявляет значительный и продолжительный анальгетический эффект, Максимальный эффект наблюдают на 5- 40 30 мин после введения. Анальгетическая активность предлагаемого аналога энкефалина в 2 раза превышает анальгетическую активность известного аналога энкефалина(Э-Arg },45 Т а блица I Соединение ЕЛ н.моль/животное 223(160-310) 146(99 -215) Лейцин-э нкефалин Метионин-энкефалин (D-Arg )-лейцин-энкефалин 5,3(2,9-9,3) (D-Arg дез-Leu )энкефалинамид 2,5(0,9-7,2) 1,8(0 5-5,6) Морфин В табл.. 2 представлен анальгетический эффект описываемого (D-Arg, дез-Leu }-энкефалинамида, 5 полученный в опытах на мышах при ин. терацистернальном введении в дозах 1-100 мкг/животных. -лейцин-энкефалина на молярной основе (табл. 1). Кроме того, описываемый аналог энкефалина в отличие от своего структурного прототипа активен при внутривенном введении(ЕД .= 28,0, 17,9-43,7 мг/кг). Характерной особенностью описан- ного аналога является значительная. пролонгация анальгетического эффекта. Продолжительность его анальгезии составляет 4 ч против нескольких минут (5-15) природных энкефалинов. Анальгетическая активность природных эн.".ефалинов и сопоставила по величине и продолжительности с анальгетической активностью морфина (табл. 1). 1О48703 Ю « 1 ! 1 Ю СЧ Q I 1 Ю а ! «I 1 I I Х I ж 1 I Ю CV с» 1. 1 Ю Ю « «) Ю « 1 Ю Ю в.I а I Э 1 Р 1 I 1 ! I 1 ь Ю 0Ь Ю С «0 Э I !-1 РУ ж Е 3g о 1 1 Ю Ю С ) Ю Ю 00 Ф.Ю ю ж I 1,1 1 I ь « Ъ 1 а I 1 ь Ю Ь е) л Ю CV Ю О Ю Ю CO O Ю Ю л Ю .Ю 00 Ф I I I и .I ° 1 1 1 Ю Ю л в Ю Ю ° Lf) .Ю 1 Ц М .8 I !0 I ° Э 1 CI !0 c3ý з ! Ю ч 1 « I I 1 Ю 00 I ч 1 I 1 1 Ю Ю Ю e Q «" « . 1 Ю o o Ч «0 Ь « ) 9 1048703 16 Эффективная доза соединения (ЕД„ ), и дозой, вызывающей первые призна" вычисленная на основании данных таб- ки токсичности (терапевтическая лиц, составляет 2,5 нмоль/жив, или широта), также достаточно велик. .1,7 мкг/жив. Из данных .табл, 2 видно, Он составляет более сотни что токсические признаки соединения 5 100 мкг/жив. ) и является безопасначинают проявляться в дозах, превы- 1,0 мкг жив. шающих эффективную в 59 раз ным для лекарственного средства. (100 мкг/жив. ), следовательно, Редактор Л. Письман Техред Т.Маточка Корректор О. Билак Заказ 1738/5 Тираж 384 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушскаянаб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 терапевтический индекс соединения /ЛД /ЕД / больше 59 и является достаточно безопасным интервалом для лекарственного средства. Интервал между дозой, вызывающей минимальный анальгетический эффект, Результаты биологических испытаИ} ний описываемого.(D-Arg дез-Leu )5 энкефалинамида показали, что предлагаемое соединение малотоксично и об-: ладает ярко выраженным анальгетическим действием при интрацистернальном введении.
