Композиция из пептидов, обладающая иммунорегуляторным свойством
Владельцы патента RU 2266297:
Терентьев Александр Александрович (RU)
Качарава Леонид Язонович (GE)
Алиханов Халлар Абдумуслимович (RU)
Изобретение относится к области медицины, в частности к новым биологически активным веществам. Предложена новая композиция из пептидов формулы H-Arg-Gly-Asp-OH и Н-Tyr-Х-Y-Glu-OH, где Х - Gln и/или Glu, Y - Cys(acm) и/или Cys. Композиция обладает простотой изготовления, способностью подавлять пролиферативную активность мононуклеарных клеток, индуцировать их супрессорную активность и секрецию ими иммуносупрессорных цитокинов ТФР-β1 и ИЛ-10. 3 з.п.ф-лы, 16 табл.
Изобретение относится к области медицины, в частности к новым биологически активным веществам (БАВ), обладающим иммунорегуляторными свойствами, и может быть использовано в практической медицине, ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии.
Известен кополимер-1 (Коп-1), выпускаемый фирмой TEVA под названием "Копаксон" (см. Монографию авторов Е.И. Гусев, Т.Л. Демина и А.Н. Бойко "Рассеянный склероз", Москва, 1997 г., стр.317).
Этот препарат обладает широкими функциональными возможностями, однако получение его отличается значительной сложностью из-за высокого молекулярного веса, что удорожает его производство.
Известна фармацевтическая композиция, применяемая для лечения рассеянного склероза путем нейтрализации антимиелиновых антител (см. патент РФ №2121850, кл. А 61 Л 38/10 от 22.10.91 г.).
Однако известная композиция не обладает иммунорегуляторными свойствами.
Техническим результатом является разработка новой синтетической композиции, обладающей иммунорегуляторными возможностями и простотой получения.
Для решения этой технической задачи предлагается композиция, обладающая иммунорегуляторным свойством, включающая по крайней мере два пептида, формулы H-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Glu и/или Gln, Y - Cys и/или Cys(acm), причем пептиды могут быть взяты в равных долях или в долях, соотношение которых составляет 1:4 соответственно, кроме того, пептиды модифицированы путем замещения каждой из групп Н и ОН как минимум одним олигопептидом или полисахаридом, а также обладает способностью индуцировать супрессорную активность мононуклеарных клеток и секрецию ими цитокинов ТФР-β1 и ИЛ-10.
Сущность изобретения заключается в том, что использование композиции с вышеуказанной формулой позволяет обеспечить расширенные функциональные возможности воздействия на мононуклеарные клетки путем способности индуцировать секрецию высокоактивных иммуносупрессорных цитокинов.
Кроме того, невысокий молекулярный вес компонентов предлагаемой композиции определяет простоту ее изготовления.
Сравнение предлагаемой композиции с ближайшим аналогом позволяет утверждать о соответствии критерию "новизна", а отсутствие в аналогах отличительных признаков говорит о соответствии критерию "изобретательский уровень".
Предварительные испытания позволяют утверждать о возможности широкого промышленного производства и использования в медицине.
Получение заявляемой композиции может быть осуществлено известными способами пептидного синтеза.
Пептиды, составляющие заявляемую композицию согласно настоящему изобретению, могут быть получены в соответствии с обычными и хорошо известными методами синтеза полипептидов. Для синтеза использовали активизированные аминокислоты с защищенными функциональными группами (фирмы: Sigma, Merk).
Синтез пептидов осуществляли обычно принятыми методами твердофазного синтеза: в частности, по Fmoc-схеме образования пептидной связи, которая предусматривает использование для временного маскирования альфа-аминогрупп флюоренил-метилоксикарбонильной (Fmoc) группы, стабильной в кислой среде, но отщепляемой основаниями. Первый пептид RGD - аргинил-глицил-аспарагиновая кислота - (H-Arg-Gly-Asp-OH) синтезировали в форме свободной кислоты на РАС-полимере фирмы MilliGen/Biosearch (США) с присоединенным к нему стартовым С-концевым аминокислотным остатком Fmoc-аспарагиновой кислоты. Реакция конденсации осуществлялась методом 1-оксибензотриазоловых или пентафторфениловых эфиров, последовательно используя соответствующие эфиры глицина и аргинина. Полноту прохождения реакции контролировали с помощью нингидринового теста. В случае неполного прохождения реакции проводили повторную конденсацию. Для отщепления пептида от полимера использовали смесь трифторуксусной кислоты (ТФА) и фенола (95/5). Очистку пептида проводили гельфильтрацией на сефадексе G-10 и характеризовали данными количественного аминокислотного анализа, аналитической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и тонкослойной хроматографии.
Синтез проводили на твердой фазе с использованием полистирольного полимера сшитого дивинилбензолом. Степень сшивки 1%. Для синтеза использовали производные L-аминокислотной фирмы "Bachem": Boc-Glu(Bzl)OH, Boc-Cys(Acm)OH и Вос2TyrOH.
Синтез проводили последовательным наращиванием аминокислот, начиная с С-конца с использованием дициклогексилкарбодиимида с добавлением N-гидроксибензотриазола. Защитные группы удалялись 50% трифторуксусной кислотой в хлороформе. Пептид отщепляли от смолы с помощью трифторметансульфокислоты. Сырой продукт подвергали очистке с помощью ВЭЖХ. И после лиофилизации получали искомый пептид.
Второй пептид перекристаллизовывали и лиофилизировали. Присутствие и последовательность аминокислот, а также чистоту пептида проверяли методом тонкослойной хроматографии, используя как цельный пептид, так и продукты его частичного и полного гидролиза. Полученный второй пептид 1-го типа соответствовал формуле: H-Tyr-Gln-Cys(acm)-Glu-OH, где acm - ацетамидометил, защитная группа для серы цистеина, которую не снимали, так как она спонтанно легко удаляется в условиях организма и в клеточных культурах, в результате чего действующим началом является пептид с формулой H-Tyr-Gln-Cys(asm)-Glu-OH.
Н - начало пептида; Tyr - аминокислотный остаток тирозина; Gln - аминокислотный остаток глутамина; Cys - аминокислотный остаток цистеина, Glu - глутаминовая кислота (глутамат) или ее остаток, ОН - конец пептида.
Для синтеза второго пептида 2-го типа с формулой H-Tyr-Glu-Cys(acm)-Glu-OH использовали тот же принцип с заменой на соответствующем этапе добавления Boc-Glu(Bzl)OH гидроксисукцинимид эфира на Boc-Glu-OH. Все реактивы и активированные аминокислоты с защищенными группами были фирменными (Sigma, Merk).
Обрабатывая пептиды с вышеуказанными формулами в присутствии ионов ртути, снимают ацетоамидометильную группу, освобождая SH группу цистеина. При этом получают пептиды с формулой без (asm).
При получении композиции по п.2 формулы смешивают первый пептид со вторым пептидом каждого типа в отдельности в соотношении долей, равном 1:4, соответственно.
При получении композиции по п.3 формулы смешивают первый пептид со вторым пептидом каждого типа в отдельности в равных долях.
При получении композиции по п.4 формулы пептиды модифицируют путем замещения каждой из групп Н и ОН как минимум одним олигопептидом или полисахаридом.
В результате могут быть получены композиции четырех различных типов. Кроме того, для получения композиции других типов использовали вместо Х у второго пептида одновременно смесь Gln и Glu. Следует отметить, что осуществляли приготовление композиции из двух пептидов в различных неравных долях. Однако преимуществ получения композиции перед композицией с пептидами в долях, соотношение которых равно 1:4, не было замечено.
Биологическая активность заявляемой композиции каждого из четырех типов определялась следующим образом.
Пример 1.
1. Исследовали действие композиции, состоящей из двух пептидов с формулами H-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Glu, Y - Cys(acm) на пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных по методу Boyum 1969 г.
Диапазон используемых доз составлял 0,03 мкг/мл - 3,00 мкг/мл.
Результаты исследований отражены в таблице 1.
| Доза в мкг/мл | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| Индекс Ингиб % | 0 | 5 | 17 | 24 | 33 | 45 | 36 | 24 | 12 | 0 |
Результаты показали, что данная композиция подавляет пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови, вызванных фитогемагглютинином (ФГА).
2. Исследовали влияние композиции на способность индуцировать супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови.
На первом этапе получают суспензию МНК методом седиментации клеток в одноступенчатом градиенте фиколл-уротрасте (метод Boyum).
Периферическую кровь берут у донора путем венопункции в одно и то же время и помещают в пробирки с раствором гепарина из расчета 1 мл крови - 20-30 ед. гепарина. Далее кровь разводят раствором Хенкса без Са++ и Mg++ в соотношении 1:2 и наслаивают на градиент фиколл-уротраст (плотность 1,078).
Затем проводят центрифугирование в режиме 400 g в течение 30 мин. Взвесь МНК из интерфазы переносят в центрифужную пробирку, добавляют раствор Хенкса без Са++ и Mg++ и производят 3 последовательных центрифугирования по 10 мин для отмывания клеток от раствора фиколл-уротраст. После 3-го центрифугирования осадок МНК ресуспензируют в 1 мл среды 199 и подсчитывают количество мононуклеарных клеток с помощью камеры Горяева.
На втором этапе МНК делят на две равные части, первую из которых культивируют без активатора супрессоров, вторую - с активатором супрессоров, в качестве которого используют исследуемую композицию, состоящую из 2 пептидов.
МНК культивируют в пенициллиновых флаконах, закрытых резиновыми пробками №14,5 при температуре 37°С. Среда культивирования RPM1-1640 с добавлением 20% сыворотки IV АВ группы крови и глютамина.
В каждом флаконе культивируют 5×106 клеток в 2,0 мл полной среды. К культуре для индукции супрессоров добавляют композицию из 2 пептидов в дозах 0,03-3,0 мкг/мл.
Культивирование клеток осуществляют 48 ч. После этого МНК отмывают от среды культивирования и осуществляют блокировку пролиферации путем обработки митомицином С - 40 мкг/мл в течение 30 мин при 37°С. Затем отмывают средой 199 с 5% сыворотки IV АВ (охлажденной) трижды. Осадок клеток ресуспензируют, подсчитывают количество ядросодержащих клеток, определяют процент жизнеспособности клеток с помощью 0,1%-ного трипанового синего раствора и разводят до необходимой концентрации. При этом все операции делают раздельно с контрольными клетками и со стимулированными композицией, а для отмывания клеток используют силиконированную посуду.
На следующем этапе в каждую часть контрольных и стимулированных композицией МНК добавляют свежевыделенные МНК, стимулированные фитогемагглютинином (ФГА), которые служат отвечающими тест-клетками в равных соотношениях (0,5×106 : 0,5×106 клеток/мл) для получения тест-культур. Культивирование их проводят в течение 72 ч. После этого с помощью Н3-тимидина оценивают пролиферацию тест-культур, и о величине супрессии судят по степени снижения пролиферации в них. Индекс супрессии (ИС) определяют по формуле:
Результаты исследований влияния композиции, состоящей из двух пептидов с формулами H-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Glu, Y - Cys(acm), на способность индуцировать супрессорную активность МНС отражены в таблице 2.
Диапазон доз 0,02-3,6 мкг/мл.
| Таблица 2. | ||||||||||
| Доза в | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| мкг/мл | ||||||||||
| Индекс | 0 | 2 | 9 | 18 | 25 | 43 | 28 | 14 | 5 | 0 |
| супр. % |
Установлено, что данная композиция в дозах 0,03 мкг/мл-3,00 мкг/мл индуцирует супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови.
Пример 2.
При исследовании композиции 2-го типа H-Arg-Gly-Asp-OH и Н-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Gln, Y - Cys(acm), повторили действия п.1 и п.2 примера 1.
Результаты исследований отражены в таблицах 3 и 4.
| Таблица 3. Действие композиции, состоящей из двух пептидов с формулами (H-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Gln, Y - Cys(acm), на пролиферативную активность МНК. | ||||||||||
| Доза в | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| мкг/мл | ||||||||||
| Индекс | 0 | 5 | 16 | 21 | 28 | 44 | 29 | 18 | 7 | 0 |
| Ингиб % | ||||||||||
| Таблица 4. Влияние композиции, состоящей из двух пептидов с формулами (Н-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Gln, Y - Cys(acm), на способность индуцировать супрессорную активность МНК. | ||||||||||
| Доза в | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| мкг/мл | ||||||||||
| Индекс | 0 | 3 | 15 | 24 | 32 | 39 | 23 | 12 | 4 | 0 |
| супр. % |
Таким образом, данная композиция также подавляет пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови, вызванных ФГА, и индуцирует супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови при использовании в дозах 0,03 мкг/мл-3,00 мкг/мл.
Пример 3.
При исследовании действия композиции 3-го и 4-го типов из 2 пептидов с H-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-Gln-Cys-Glu-OH и H-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-Glu-Cys(acm)-Glu-OH, взятых в равных долях и в соотношении 1:4, повторили действия п.1 и п.2 примера 1.
Результаты исследований действия композиции из двух пептидов с H-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-Gln-Cys-Glu-OH на пролиферативную активность и на способность индуцировать супрессорную активность МНК отражены в таблицах 5 и 6.
Диапазон доз 0,02-3,6 мкг/мл.
| Таблица 5. | ||||||||||
| Доза в | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| мкг/мл | ||||||||||
| Индекс | 0 | 4 | 18 | 30 | 37 | 43 | 31 | 22 | 11 | 0 |
| Ингиб % |
| Таблица 6. | ||||||||||
| Доза в | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| мкг/мл | ||||||||||
| Индекс | 0 | 4 | 11 | 18 | 25 | 41 | 26 | 11 | 3 | 0 |
| супр. % |
Результаты исследований действия композиции из двух пептидов с Н-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-Glu-Cys(acm)-Glu-OH на пролиферативную активность и на способность индуцировать супрессорную активность МНК отражены в таблицах 7 и 8.
Диапазон доз 0,02-3,6 мкг/мл.
| Таблица 7. | ||||||||||
| Доза в | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| мкг/мл | ||||||||||
| Индекс | 0 | 6 | 14 | 30 | 35 | 46 | 29 | 18 | 12 | 0 |
| Ингиб % | ||||||||||
| Таблица 8. | ||||||||||
| Доза в | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| мкг/мл | ||||||||||
| Индекс | 0 | 4 | 10 | 17 | 31 | 49 | 33 | 21 | 5 | 0 |
| супр. % |
В результате получили, что данные композиции подавляют пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови, вызванных ФГА, и индуцируют супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови при использовании в дозах 0,03 мкг/мл - 3,00 мкг/мл.
Кроме того, исследовались и другие типы (варианты) заявляемой композиции, состоящей из двух пептидов, которые также подтвердили их способность подавлять пролиферативную активность и индуцировать супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови человека. Следует отметить значительную простоту получения всех вариантов композиций из двух пептидов.
Пример 4.
Исследовали влияние композиции, состоящей из двух пептидов с формулами (H-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Gln и/или Glu, Y - Cys(acm) и/или Cys, на способность индуцировать продукцию цитокинов - трансформирующего фактора роста бета 1 (ТФР-β1) и интерлейкина-10 (ИЛ-10) мононуклеарными клетками (МНК) периферической крови.
На первом этапе получали суспензию МНК методом седиментации клеток в одноступенчатом градиенте фиколл-утротраста (метод Boyum).
МНК делили на 2 равные части, первую из которых культивировали без композиции, состоящей из двух пептидов, вторую с композицией, состоящей из двух пептидов.
МНК культивируют в пенициллиновых флаконах, закрытых резиновыми пробками №14,5 при температуре 37°С. Среда культивирования RPMI-1640 с добавлением 20% сыворотки IV АВ группы крови и глютамина.
В каждом флаконе культивировали 5×106 МНК в 1 мл полной среды. К культуре МНК для индукции выработки цитокинов ТФР-β1 и ИЛ-10 добавляли композицию, состоящую из двух пептидов.
Культивирование клеток осуществляли 24 часа. После этого культуральную среду отделяли от клеток путем центрифугирования (1000 g 10 минут) и из нее забирали 500 мкл, необходимых для выполнения анализа.
При определении количества ТФР-β1 в культуральной среде первоначально производили экстракцию образцов. Этот этап анализа позволяет освободить ТФР-β1 из комплексов, сделав его доступным для анализа.
Для этого в полипропиленовую пробирку вносили 0,25 мл (250 мкл) культуральной среды и 0,05 (50 мкл) экстрагирующего раствора. Перемешивали содержимое на вортексе. Инкубировали 30 минут при 4°С. Добавляли в пробирку 250 мкл рабочего буферного раствора для разведения стандартов. На этом этапе происходит разбавление культуральной среды в 2,2 раза.
Далее брали требуемое для проведения анализа число 8 луночных стрипов из разборного микропланшета, покрытого антителами к ТФР-β1.
Для повышения достоверности результатов анализа исследуемые и контрольные образцы ставили в дубликатах, используя для каждого образца две лунки. Вносили по 200 мкл каждого стандарта и экстрагированного образца или клотрона в соответствующие лунки. Добавляли по 500 мкл биотинилированных антител к ТФР-β1 во все лунки, перемешивали путем постукивания по планшету. Закрывали планшету пленкой и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Полностью удаляли содержимое лунок. Промывали все лунки 4 раза рабочим буферным раствором, добавляя его каждый раз по 400 мл во все лунки. При этом каждый раз полностью заполняли и удаляли из лунок стрипов раствор. После завершения промывки от остатков влаги освобождали постукивая перевернутыми стрипами по фильтровальной бумаге. Добавляли 100 мкл рабочего раствора конъюгата стрептавидин-пероксидазы в каждую лунку, за исключением хромогенного бланка. Закрывали планшету пленкой и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Полностью удаляли содержимое лунок. Промывали лунки 4 раза рабочим буферным раствором. Далее вносили во все лунки по 100 мкл хромогенного раствора тетраметилбензидина (ТМБ). Инкубировали 20-30 минут при комнатной температуре в темноте до появления голубой окраски в лунках с калибровочной пробой с максимальным содержанием ТФР-β1.
Вносили в каждую лунку по 100 мкл стоп раствора (раствор 1 н. серной кислоты) для остановки ферментативной реакции. Перемешивали реагенты путем осторожного постукивания по держателю стрипов. Цвет раствора изменялся с голубого на желтый.
Регистрацию результатов проводили фотометрически на фотометре для иммуноферментного анализа при длине волны 450 нм сразу после остановки ферментативной реакции.
Для определения концентрации ТФР-β1 в исследуемых образцах строили калибровочную кривую в координатах: ось абсцисс - концентрация ТФР-β1 в калибровочных пробах (рг/мл); ось ординат - соответствующее значение оптической плотности.
По калибровочной кривой, исходя из полученного значения оптической плотности, определяли концентрацию ТФР-β1 в исследуемых образцах. Если образцы были предварительно разбавлены, полученные значения концентраций умножали на коэффициент разведения (10, 100, 1000 и т.п.).
Для определения количества ИЛ-10 в культуральной среде брали требуемое для проведения анализа число 8 луночных стрипов из разборного микропланшета, покрытого антителами к ИЛ-10.
Для повышения достоверности результатов анализа исследуемые и контрольные образцы ставили в дубликатах, используя для каждого образца две лунки.
Вносили 50 мкл каждого стандарта, испытуемого образца или контрольного образца в соответствующие лунки. Добавляли по 50 мкл инкубационного буфера для лунок, содержащих стандарты, и 50 мкл разбавляющего рабочего раствора в лунки, содержащие культуральную среду.
Закрывали планшет пленкой и инкубировали 2 часа при комнатной температуре.
Полностью удаляли содержимое лунок.
Промывали все лунки 4 раза рабочим буферным раствором, добавляя его каждый раз по 400 мкл во все лунки. При этом каждый раз полностью заполняли и удаляли из лунок стрипов раствор. Добавляли по 100 мкл биотинилированных антител к ИЛ-10 во все лунки, перемешивали путем постукивания по планшету.
Закрывали планшет пленкой и инкубировали 2 часа при комнатной температуре. Полностью удаляли содержимое лунок. Промывали все лунки 4 раза рабочим буферным раствором. Добавляли 100 мкл рабочего раствора конъюгата стрептавидин-пероксидаза в каждую лунку за исключением хромогенного бланка.
Закрывали планшет пленкой и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Полностью удаляли содержимое лунок. Промывали лунки 4 раза рабочим буферным раствором.
Далее вносили во все лунки по 100 мкл хромогенного раствора тетраметилбензидина (ТМБ).
Инкубировали 20-30 минут при комнатной температуре в темноте до появления голубой окраски в лунках с калибровочной пробой с максимальным содержанием ИЛ-10.
Вносили в каждую лунку по 100 мкл стоп раствора (раствор 1 н. серной кислоты) для остановки ферментативной реакции. Перемешивали реагенты путем осторожного постукивания по держателю стрипов. Цвет раствора изменялся с голубого на желтый.
Регистрацию результатов также проводили фотометрически на фотометре для иммуноферментного анализа при длине волны 450 нм сразу после остановки ферментативной реакции.
Для определения концентрации ИЛ-10 в исследуемых образцах строили калибровочную кривую в координатах: ось абсцисс - концентрация ИЛ-10 в калибровочных пробах (рг/мл); ось ординат - соответствующее значение оптической плотности.
По калибровочной кривой исходя из полученного значения оптической плотности определяли концентрацию ИЛ-10 в исследуемых образцах. Если образцы были предварительно разбавлены, полученные значения концентраций должны быть умножены на коэффициент разведения (10, 100, 1000 и т.п.).
В результате проведенных исследований было установлено, что композиция, состоящая из двух пептидов обладает способностью индуцировать продукцию одновременно двух цитокинов - ТФР-β1 и ИЛ10, мононуклеарными клетками периферической крови.
Пример 5-1.
Действие композиции, состоящей из двух пептидов с формулами Н-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Glu, Y - Cys(acm), на пролиферативную активность МНК, при соотношении первого пептида со вторым 4:1.
Диапазон используемых доз составлял 0,02 мкг/мл-3,6 мкг/мл.
Результаты исследований отражены в таблице 9.
| Таблица 9. | ||||||||||
| Доза в | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| мкг/мл | ||||||||||
| Индекс | 0 | 4 | 12 | 21 | 28 | 41 | 27 | 11 | 4 | 0 |
| Ингиб % |
Пример 5-2.
Результаты исследований влияния композиции, состоящей из двух пептидов с формулами H-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Glu, Y - Cys(acm), на способность индуцировать супрессорную активность МНС при соотношении первого пептида со вторым пептидом 4:1 отражены в таблице 10.
Диапазон доз 0,02-3,6 мкг/мл.
| Таблица 10. | ||||||||||
| Доза в | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| мкг/мл | ||||||||||
| Индекс | 0 | 3 | 7 | 15 | 26 | 39 | 25 | 11 | 4 | 0 |
| супр. % |
Пример 6-1 и 6-2.
Результаты исследований действия композиции, состоящей из двух пептидов с формулами H-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Gln, Y - Cys(acm), на пролиферативную активность и на способность индуцировать супрессорную активность МНК при соотношении первого пептида со вторым пептидом 10:1 отражены в таблицах 11 и 12.
Диапазон доз 0,02-3,6 мкг/мл.
| Таблица 11. | ||||||||||
| Доза в | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| мкг/мл | ||||||||||
| Индекс | 0 | 7 | 12 | 17 | 22 | 29 | 20 | 10 | 5 | 0 |
| Ингиб % | ||||||||||
| Таблица 12. | ||||||||||
| Доза в | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| мкг/мл | ||||||||||
| Индекс | 0 | 6 | 12 | 18 | 23 | 32 | 20 | 11 | 5 | 0 |
| супр. % |
Пример 7-1 и 7-2.
Результаты исследований действия композиции из двух пептидов с H-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-Gln-Cys-Glu-OH на пролиферативную активность и на способность индуцировать супрессорную активность МНК при соотношении первого пептида со вторым пептидом 1:4 отражены в таблицах 13 и 14.
Диапазон доз 0,02-3,6 мкг/мл.
| Таблица 13. | ||||||||||
| Доза в | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| мкг/мл | ||||||||||
| Индекс | 0 | 7 | 16 | 22 | 28 | 39 | 25 | 19 | 6 | 0 |
| Ингиб % | ||||||||||
| Таблица 14. | ||||||||||
| Доза в мкг/мл | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| Индекс супр. % | 0 | 3 | 9 | 19 | 26 | 38 | 24 | 12 | 4 | 0 |
Пример 8-1 и 8-2.
Результаты исследований действия композиции из двух пептидов с Н-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-Glu-Cys(acm)-Glu-OH на пролиферативную активность и на способность индуцировать супрессорную активность МНК при соотношении первого пептида со вторым пептидом 1:10 отражены в таблицах 15 и 16.
Диапазон доз 0,02-3,6 мкг/мл.
| Таблица 15. | ||||||||||
| Доза в | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| мкг/мл | ||||||||||
| Индекс | 0 | 5 | 10 | 18 | 24 | 31 | 21 | 12 | 6 | 0 |
| Ингиб % | ||||||||||
| Таблица 16. | ||||||||||
| Доза в | 0,02 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | 0,3 | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,0 | 3,6 |
| мкг/мл | ||||||||||
| Индекс | 0 | 3 | 7 | 12 | 22 | 29 | 23 | 16 | 6 | 0 |
| супр. % |
Таким образом, примеры 5-1, 5-2, 6-1, 6-2, 7-1, 7-2, 8-1, 8-2, в которых пептиды смешивались в соотношении 4:1, 10:1, 1:4 и 1:10, свидетельствуют об отсутствии преимуществ получения данных композиций перед композицией с пептидами в долях, соотношение которых равно 1:1.
Пример 9.
Исследовали влияние композиции, состоящей из двух пептидов с формулами H-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Glu и/или Gln, Y - Cys и/или Cys(acm), модифицированной путем замещения каждой из групп Н или ОН олигопептидом или полисахаридом, на пролиферативную активность, способность индуцировать супрессорную активность МНК и продукцию цитокинов - ТФР-β1 и ИЛ-10.
Пример замены Н группы на полисахарид декстран.
К 10 мл 1% раствора декстрана молекулярная масса 10000 (фирма Sigma), в дистиллированной воде добавляли 100 мл периодата натрия (фирма Sigma) и оставляли на магнитной мешалке на 3 часа, затем раствор диализовали и добавляли композицию с равным содержанием пептидов в количестве 1 мг. После часа инкубации добавляли 2 г боргидрида натрия (фирма Sigma) и продолжали инкубацию еще в течение часа. После чего раствор диализовали, подвергали стерилизации путем пропускания через мембранные фильтры и использовали в иммунологических методах. Таким образом осуществлялось присоединение полисахаридных групп.
С целью изучения безопасности заявляемой композиции из двух пептидов проводили изучение ее острой токсичности. Изучение острой токсичности проводили в соответствии с Методическими рекомендациями Фармакологического комитета РФ «Требования к доклиническому изучению общетоксичного действия новых фармакологических веществ», Москва, 2001 г. Результаты исследования показали, что при внутрибрюшинном введении 1000-кратной дозы композиции не оказывалось острого токсичного действия и при этих дозах оказалось невозможным достигнуть его LD50. Таким образом, предлагаемая композиция, состоящая из двух пептидов, не является токсичной.
ОН известно для целого ряда молекул, обладающих иммунорегуляторными свойствами: альфа-фетопротеина, фибронектина и некоторых молекул клеточной адгезии. Поэтому модификация пептида H-Arg-Gly-Asp-OH путем замены Н и/или ОН как минимум одним олигопептидом или полисахаридом, увеличивая размеры молекулы, существенно не изменяет специфичности действия и иммунорегуляторной возможности, присущей пептиду H-Arg-Gly-Asp-OH. Аналогично возможна модификация второго пептида путем замещения его Н и ОН групп полисахаридными или пептидными группами.
С целью изучения безопасности заявляемой композиции из двух пептидов проводили изучение ее острой токсичности. Изучение острой токсичности проводили в соответствии с Методическими рекомендациями Фармакологического комитета РФ «Требования к доклиническому изучению общетоксичного действия новых фармакологических веществ», Москва, 2001 г. Результаты исследования показали, что при внутрибрюшинном введении 1000-кратной дозы композиции не оказывалось острого токсичного действия и при этих дозах оказалось невозможным достигнуть его LD50. Таким образом, предлагаемая композиция, состоящая из двух пептидов, не является токсичной.
Хотя приведенное выше изобретение было описано довольно подробно для иллюстрации, для среднего специалиста в данной области будет вполне понятно, в свете описания этого изобретения, что могут быть сделаны определенные изменения и модификации изобретения без отхода от идеи или сферы действия предлагаемой формулы изобретения.
1. Композиция, обладающая иммунорегуляторным свойством, включающая по крайней мере два пептида формулы H-Arg-Gly-Asp-OH и H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х-Gln и/или Glu, Y-Cys(acm) и/или Cys, которые могут быть модифицированы путем замещения каждой из групп Н и ОН как минимум одним олигопептидом или полисахаридом.
2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что пептиды взяты в долях, соотношение которых составляет 1:4 соответственно.
3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что пептиды взяты в равных долях.
4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что обладает способностью подавлять пролиферативную активность мононуклеарных клеток индуцировать их супрессорную активность и секрецию ими цитокинов ТФР-β1 и ИЛ-10.
