Аналог энкефалина,обладающий пролонгированной анальгетической активностью

 

СОЮЗ COBETCHHX

ВЗЯЛ ЛИ

РЕСПУБЛИК

OCNAPOTBEHHbN КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPbFNA

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H A8TGPCHGMY.С8ИДДТЕЛЬОЧИУ

Ь

Ю

Н Tyr - D Arg - Gly - Phe ОН (21) 3352766/23-04 (22) 30. 10. 81 (46) 30.03.85. Бюл. Р 12 (72) И.В. Боброва, Г.И. Чипенс и Н,А. Абиссова (71) Ордена Трудового Красного Эиа-: иени институт органического синтеза

АН Латвийской CCP (53) 547..964.4.07(088.8) (56) 1.. Hughes J. Smith Т.M. Kos-.

terlitz Н.Q., Fortergill L.Н, Morgan В.А., Horris R.Н. "Identification of tvo related pentapeptidis

from the brain vith potent 0piate

Agonist activity" Nature 1975, 258, с..577.

2. Buescher Н.Н., Hill R.Ñ., Roe

mer 9., Cardinaux F., Closse А., Hauser 0, Pless I. "Evidence for

ana1gestic activity of enkephalin

in the. mouse .: Nature 1976, 261, с. 423

3. Kubota И., Higase О. "Eukephalin analogs containing the oipepti-:

de unit . х - Arg (kyotorphin)".

Chem. Pharm. Bull. 1980, 28, У 9, с. 2580

4(51) С 07 С 5/10 ° А 61 37 02 (54), АНАЛОГ ЭНКЕФАЛИНА, ОВЛАДАЮЙЯЙ

ПРОЛОНГИРОВАННОЙ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТЬЮ. (,57) Аналог зыке@апина формулы обладающий нролонгированной анальгетической активностью, 1048705

Изобретение относится к новому биологически активному соедииеннюаналогу энкефалина, обладающему пролонгированной аиальгетической активностью, которое может найти применение в медицине, Известны природные метионин- и лейцин — энкефалины формул: Н Tyr—

01у-Gly-Phe-Ией Ойн Н Туг - 61у-GlyPhe-Ьеи ОН, соответственно Щ, t, 10 проявляющие морфииоподобную активность в опытах на специфических моделях опиатного рецептора и подавляющие стереоспецифическое связыва- . ,ние с рецептором опнатного антаго- 15 ниста налоксона s гомогенатах мозга.

Однако известные метионин- и лейцин - энкефалины проявляют слабую и кратковременную (5-15 мнн) анальгезню при внутрижелудочковом Введении 20 в мозг мыши (2) и не активны при внутривенном, пероральном и других способах введения.

Наиболее близким но химической

25 структуре к описываемому соединению является аналог энкефалина — (9— .Arg ) лейцинэнкефалин, проявляющий анальгетическую активность при внутримозговом введении. При внутривенном введении этот аналог анальгезией не обладает (3).

Цель изобретения †. расширение арсенала средств воздействия на живой организм.

Поставленная цель достигается 35 описываемыми аналогом энкефалина формулы

Н-Tyr-Р Arg — Gly — Phe ОН, 40 обладающим пролонгированной анальгетической активностью. (D-Arg дез-I. еи ) — энкефалин

5 синтезирован известными методами пептидной химии в растворе согласно 15 приведенной схеме с использованием в качестве конденсирующего агента дициклогексилкарбодиимида (ДСС), а также пентафторфениловых эфиров третбутилоксикарбониламннокислот. Гуани- 50 диновая функция В-аргинина была защищена нитрогрунпой, гидрокснл тирозина-бензильным радикалом. Карбоксильную группу глицина защищали этерифнкацней. Вос-группы в синтезе 55 пептида удаляли 50Х-ным раствором трифторуксусной кислоты (TFA) в хлористом метилене. Нитро- н бенэильную защиты снимали каталитичесг гидрогенолизом.

Общая схема синтеза приведена на чертеже.

П р и и е р. Для синтеза (D-Агр, деэ-L eu )-знкефалина используют аминокислоты и их производные фирмы

"Reanal" (Венгрия).,Все аминокислоты кроме 9-аргиннна имеют I. †êîíôèãóðàцию. Температуру плавления. веществ определяют в. капилляре (без коррекции). Индивидуальность промежуточных соединений контролируют с помощью

ТСХ на пластинках "Silufol" (ЧССР)

s следуиш1нх.системах растворителей: хлороформ-этанол-уксусная кислота; (АсОН) ° 85: 10:5 (А), н-бутанол-пири-" дин-AcOH-H,,O, 15:10:3:6 (В) н-бутанол-АсОН-Н О, 4:1:1 (С). Аналог энкефалнна хроматографируют на пластинках фирмы "Neck" в системах: хлороформ-метанол-АсОН-Н,O, 30>20:4:6 (Д).

Удельное оптическое вращение пептидов измеряют на поляриметре "Perkin-Elmer 141 С" (ФРГ). Кислотный гидролиз проводят s запаянных ампу лах в 6 н. соляной кислоте при

120 С в течение 24 ч. Амннокислотный состав определяют на анализаторе

"Ieol-3". Для всех соединений данные элементного анализа удовлетворительно совпадают с вычисленным содержанием С, Н, й,.

Этиловый эфир N"-трет-бутилоксикарбонил-N -нитро-9-аргинилглнци6 на (1).

К раствору 6,38 г (20 ммоль)

N -трет-бутнлоксикарбоннл-N -нитррЭ -аргинина и, 3,24 r (24 ммоль). 1оксибензотриазола в 20 мп днметилформамида (ДИФА) нри охлаждении до

-15 С прибавляют 4 ° 12 г (20 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (ДСС) в

8 мл ДИФА, перемешивают 3,ч при

0 С, затем добавляют 3,07 г (22, моль) этилового эфира глицина гидрохлорнда, 3,08 мл (22 ммодь) трнэтилемииа и перемешивают 24 ч пун

20 С. Реакционнув массу разбавляют этилацетатом и водой (до разделенна слоев). Этилацетатный слой отделякэ и промывают. последовательно 5Х-ным раствором КНЗО,, 5Х-ным раствором йаНСО водой, насыщенным раствором

ЯаС1, сушат над безводным Яа, 80 .

Растворитель отгоняют, остаток перекристаллизовывают из этилацетата.

1048

Выход: 6,24 r (777), т.пл. 119оС (размягчается при 96 С), /ec/з =

0 24

=-13,5 (с 1, ДМФА); Rg=Oэ68 (В) .

Этиловый эфир И-трет-бутилоксикарбонил-0-бензил-L-тирозил-N -нит- 5 ро-D-аргинилглицина.

4,04 r (10 ммоль) дипептида (1) растворяют в 15 мл 507-ного раствора TFA в дихлорметане и выдерживают

30 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром и сушат в ва-, куум-эксикаторе над КОН. Получают

4,01 г (96X) трифторацетата (II), R2=0,48 (В).

2 г (5 ммоль) трифторацетата (II) растворяют в 10 мл ДМФА, охлаждают до -5 С и при перемешивании добавляо ют 0,7 мл (5 ммоль) триэтиламина в

2 мл ДИФА и 2,46 r (5 ммоль) п-нитро, фенилового эфира N-трет-бутилоксикар- бонил-О-бензил-L-тирозина, растворен-. ного в 10 мл ДМФА. Смесь выдерживают

1 ч при -5 С, 24 ч при О С и еще о о

24 ч при комнатной температуре. Затем реакционную массу выливают в 500 мл воды со льдом, выделившееся в осадок вещество отфильтровывают. Осадок растворяют в этилацетате и промывают

57.-ным раствором КНБО,1, водой, 57-ным раствором КНСО, водой, насыщенным 30 раствором NaCI и высушивают над без-, водным Na, ЯО . Растворитель отгоняют, продукт перекристаллизовывают из этилацетата. Пблучают этиловый эфир . И-трет-бутилоксикарбонил-0бензил-L-тирозил-С-нитро-D-аргинил- . глицина

Выход: 1,77 (547) трипептида (III), т.пл. 162-164 С, /о /> =+11,1 (с

ДИФА); R =0,65(A) .. 40

N-трет-бутилоксикарбонил-О-бензилL-тирозил-N -нитро-D-аргинилглицин

Q (тч) .

0,66 r (1 ммоль) трипептида (IIX) растворяют в 15 мл метанола, 45 прибавляют 1 н. раствор NaOH до рН 10-11 и выдерживают .несколько минут до окончания гидролиза (хроматографический контроль). Отгоняют растворитель, добавляют воду и под- 50 кисляют 1 н HCl до рН 3. Выпавший осадок отфильтровывают и хроматогра= фируют на колонке с силикагелем в системе хлороформ-этанол-этилацетат- .

AcOH-H О, 85:5:8:2:0,25, Получают 55

0,34 г. (547) трипептида (IV), т.пл. 86 С, /о /в =+5,5 (с 1, ДМФА);

R =О,6О (С).

N-трет-бутилоксикарбонил-0-бензил-1-тирозил-N -нитро-D-аргинилглицил-L-фенилаланин.

3,15 г (5 ммоль) трипептида (IV) растворяют в 10 мл этила етата, охлаждают до 0 С и при перемешивании о добавляют 1,01 г (5,5 ммоль) пентафторфенола и 1,13 г (5,5 ммоль) ДСС, растворенных в этилацетате. Через о

2 ч смесь охлаждают до -10 С, выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают, растворитель отгоняют, маслообразный остаток растирают с гексаном до затвердения. Получают

3,54 г пентафторфенилового эфира (V), К =0,90 (С).

0,73 г (4,45 ммоль) Ь-фенилаланина (VI) растворяют в 6 мл ДИФА и при перемешивании добавляют 0,62 мл (4,45 ммоль) триэтиламина в 2 мл

ДМФА и 3,54 r (4,45 ммоль) пентафторфенилового эфира (У), растворенного в 4 мл ДИФА. Реакционную массу перемешивают несколько часов, ДИФА отгоняют при 40 С, остаток растворяо ют в этилацетате и обрабатывают аналогично соединению (III). Продукт, полученный после отгонки раствори-теля, хранят в эксикаторе. Получают

N-трет-бутилоксикарбонил-0-бензил-Lтирозил-G-нитро-D-аргинил-глицил-Ьфениланин (VII).

Выход: 1,43 г (41,5X) защищенного тетрапептида (VII), Rg=0,27 (А, "Nerk").

L-тирозил-D-аргинил-глицил-Ьфенилаланин.

0,320 r (0,412 ммоль) тетрапептида (VII) растворяют в 6 мл 50Х-ного раствора TFA в дихлорметане и выдерживают в течение 30 мин. Раствор упаривают, остаток растирают с эфиром, сушат в вакуум-эксикаторе над

КОН. Получают 0,300 г трифторацетата тетрапептида (VIII); R =0,61 (Д).

К раствору 0,300 г (0,380 ммоль) соединения (VIII) в 5 мл метанола добавляют палладиевую чернь, 0,2 мл уксусной кислоты и гидрируют 6 ч о при 20 С. Катализатор отфильтровы,вают, фильтрат угаривают досуха, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром на фильтре, сушат над КОН в вакууме. Полученный продукт (0,250 г) очищают на

КМ-целлюлозе (СИ-32, фирма Whatman") в аммоний-ацетатном буфере (градиентное элюирование) . Поглощение раствора

1I048705 измерялось при 206 и 254 нм (Uvicord — III, I КВ", П!лоция) . Соответствующие фракции собирают и лиофилизу.ют. Получают L-тирозил-F-аргинил-гли- цил-L-фенилаланин .(IX). 5 .Выход: О, 135 г (52Х) тетрапептида энкефалииа (IX), /М/ =+46,6 (с 1, 0,2 н АсОН);,Ri=0,4 (Д); Ri=0,5 (В), данные аминокислотного анализа удовлетворительны.

Биологическая активность (D-Arg, дез-L en )-энкефалина была исследована в опытах пчшо по методу

Беда Н. at а1.

В работе использованы беспородные мыши-самцы массой 20 r. Исследуемое вещество, растворенное в стерильном физиологическом растворе, вводят при помощи. I-образной иглы в

cisterna magna мозга неанестезированным мышам в количестве 10 мкл. Был исследован диапазон доз: 0,05—

100,0 мкг/жив. Контрольным животным вводят 10 мкл стерильного физиологического раствора. Каждая экспериментальная группа состоит из 10 мьпней.

Анальгетический эффект описываемого соединения оценивают по тесту "tail—

pinch" при помощи артериального зажима, накладываемого на основание хвос- З ) та. Определение болевой р!еакции проводят через 5, 15, 30, 60, 90 мин после введения и затем каждые 30 мин до исчезновения анальгетической реакции, Результаты выражают альтер- 35 нативным методом в проценте мышей, показавших анальгетическую реакцию.

При вычислении ЕД (эффективная доза исследуемого вещества, которая вызывает анальгетический эффект у 4

50Х подопытных животных) используют метод Литчфилда и Уилкоксона. Анальгетическая активность исследованных соединений приведены в табл. 1, 2 и 3. Как видно из табл. 1, 2 и 3 (9-Arg дез-L eu )-энкефалин обладает выраженной аиальгетичеекой активностью. Максимальный эффект наблюдается на 5-30 мии после введения.

Анальгетическая активность описывае- >б мого аналога энкефалина значительно превышает активность природных энкефалинов (1,2) и в 12 раз превышает анальгетическую активность прототипа — (D-Arg )-лейцинэнкефалина (3), а также в 4 раза превышает анальге зию морфина на молярной основе (cM. табл. 1). Более того, описываемый аналог энкефалина в отличи своего структурного аналога акт;;.аен при знутривенном введении (ЕЛ, =

=19,0 мг/кг).

Характерной особенностью синтезированного аналога является значительная пролонгация анальгетического эффекта. Продолжительность анальгетической реакции при Egeo 8 составляет 1,5 ч против 15 мин у энкефалннов или, например, 30 мин у известного аналога энкефалина с длительным действием . — (D-Ala )-метионинэнкефалинамида. Описываемое соединекие в дозе 25 мгк/животное вызывало анальгезию 88Х в течение 5 ч при интрацистернальном введении, при внутривенном введении дозы

130 мг/кг продолжительность анальгезии превышала 6,5 ч. Токсических явлений при этих дозах не наблюдалось.

Поскольку анальгетическая активность описываемого аналога энкефалина была исследована в.диапазоне доз от .0,05 до 100 мкг/животное, то на основании этих данных (см. табл. 3) была вычислена эффективная доза (ЕД ), составившая

0,44 нмоль/животное или 0,3 мкг/жи-. вотное.

Из данных таблицы видно, что токсические признаки соединения начинают проявляться в дозах, превышающих эффективную в 333 раза . IO0 мкг/животное

), следовательно, терапевтический индекс Лд > (ЕП ) составляет величину большую чем

333, и является достаточно безопасным интервалом для лекарственного средства.

Интервал между дозой, вызывающей минимальный анальгетический эффект, и дозой, вызывающей первые признаки токсичности (терапевтическая широта), также достаточно велик. Он составляет

100 мкг/животное же является безопасным для, лекарственного средства.

Проведенные исследования показали

/ что описываемый (D-Arg дез-Leu )энкефалин может найти применение в медицине в качестве анальгетика, пролонгированным действием.

1048705

Таблица 1

Анальгетическая активность энкефалина и его аналогов при интрацистернальном введении мышам (метод tail pinch).

ЕД ммоль/животное

Соединение пп

Лейцин-энкефалин (2j

223(160-310)

146 (99-2 15) 15

2 Метионин-энкефалин f2) (D-Arg2)-лейцинэнкефалин (3) 5,3(2,9-9,3) (D-A1g )-метионин-энкефалинамид

О, 58 (О, 39-0, 92) 30

0,44(0,15-1,62)

1,86(0,5-5,6) 90 .

5-15

6 Морфин

1) ЕД вЂ” эффективная доза вызывающая реакцию у 50% подопытных

so

Ф животных.

2) ЕДьо- о

3) в работе использовался морфин-гидрохлорид производства

Ташкентского ХФЗ.

Та блица 2

Анальгетическая активность (D-вгя2, дез-Leu ) энкефалинов при внутривенном введении мышам (метод tail pinch) Доза, мг/кг

Время определения анальгетической активности, мин

5 т r

30 60 90

О

О О

43Х

60% 57X;:: 29Х

14Х

50

130

1ООХ 1ООХ 1О0Х,. 100%

100Х анальгезия 100Х держалась более

6,5 ч (D-Arg, дез-L еп )6 энкефалин (Описываемое соединение) 43% 71%

80% 80Х

57X:- О

60% . 20X

Время максимального эффекта (мин) родолжительность анальгезии (мин) 104870

Таблица 3

Анальгетическая активность (D-Arg, дез-L u ) энкефалина при интрацистернальном введении мышам

Анальгезия через 1 мин, 7

Соединение

Доза мкг/животное

DArg — дез Leu

1 ,энкефалин

10

0 05

0,10

35

85 55

90 90 i 00 100

88 88

1,00

80

5,00

100

100

100

7,00

88 88

25,00

100,00

60/20* 60/20 60/20 40/30 40/30

Продолжение табл.3

Анальгеэия через 1 мин, Ж

Соединение

4 5

D-Arg — дез Ееа энкефалин

50 45

50

80 80 40

88 88 88 88 88

40/30 40/30 40/30 40/30 40/30 30/50

607. — анальгезия (6 мьш ей из 10 показали анальгезию)

207. †.летальный исход (2 мыши из 10 умерли на 5-ой мин после введения) т

1048705 . l

СоетазйФель И.Карбачннская

Редактор Е.Дувникова Tentpeg T.Èàòo÷êà Корректор И.Леонтюк Заказ 1738И : : Тира@ ЗЙЙ Подписное ВНИКНИ Государственногв комитета СССР по делам изобретений и. открытий

113035, Иосква, Ж-ЗЗ ; Раушская наб., д. 4/5

Филиал ЦПП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная, 4