Способ определения активности неорганической пирофосфатазы

 

СПОСОБ -ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ПИРОФОСФАТАЗЫ, предусматривающий проведение ферментативной реакции с пирофосфатом в присутствии ионов одновременное измерение потенциала катиончувствительного электрода с последующим определением активности по калибровочной кривой в зависимости от величины потенциала или по объему добавляемого пирофосфата при поддержании потенциала электрода на постоянном уровне, отличающийс я тем, что, с целью повышения точности определения, процесс ведут в присутствии ионов Си, а в качестС «б , ве электрода используют Си селективный электрод. (Я

COlO3 СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„„80„„1049545 А (50 С 12 Q 1/42

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (2l ) 3351501/2 8-1 3 (22) 28.10.81 (46) 23.10.83. Бюл. Р 39 (72) Е.Б..Костенко и А.А.Байков (71) Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена.

Трудового Красного Знамени государственный университет им. М.В.Ломоносова (53) 577.15(088.8) (56) 1, Патент США 9 3933593, кл. 195-103.5, 1976.

2. Бакулева Н.П., Костенко E.Á., Байков А.A и Аваева С.М. Обнаружение и характеристика дополнительного центра присоединения субстрата и его аналогов у неорганической пирофосфатазы.-"Биохимия", 1981, т.46, вып, 5, с.832-838. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ НЕОРГАНИЧЕСКОИ ПИРОФОСФАТАЗЫ, предусматривающий проведение ферментативной реакции с пирофосфатом в присутствии ионов М +2и одновременное измерение потенциала катиончувствительного электрода с последующим определением активности по калибровочной кривой в зависимости от величины потенциала или по объему добавляемого пирофосфата при поддержании потенциала электрода на постоянном уровне, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности определения, процесс ведут в присутствии ионов Cu+2, а в качест.ве электрода используют Си -селек- g

+2» тивный электрод.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относит<=я к биохими и аналитической химии, касается ОпРЕДЕЛЕНИЯ аКтИВНОСтИ фЕРМЕНта c!COP" ганической пирофосфатазы и может быть использовано Б медипинет !.7;:1(робиологической и пищевой отрасля:.: промышленности.

Известен сп!ектрофото((етрит(еск(11! способ определения ферментатипной аК ТИВ НОСТИ В СЛУЧа ЛХ > }(ОГ>эа И 3 т/т(;:.Рмая реакция сопрово::-;дается и зменением поглощения света или когда продукт реакции — субс,pBT дРУГОГQ 3ермента, реакция котQpo! Сопровождается изменением поглощения света,тогда последний фермент добавляот Б спектрофотометрическу:о кювету.

В настоящее время все больтаее распространение !!олуча}от (.по(.об>: —. определения актив((ост(1 ф рмен.!.«в, Основанные на рог-icTpBi!HJ(!!з((<=«(0((1!»! «

ПРОИСХОДЯ!.ТИХ ПР:т ПРОТ-..Ка:IИ;. В ..Of» де различных элек:poхи.«<ичс(ких процессов. Такие с"ir co;>û обо(ада(от

ВЫСОКОЙ -TO Jf OCT :О lIP. "!1(c(0 (TTBT СЛ<- F. ного оборудования > «Опр тделе!!и(-:;--;с

ЗаНИМаЕт МНОГО ВРЕМг lf;1, Известен метод 01»>з (е«(ен(я акти:.:НОСТИ фЕРМЕ!(тОБ С Пг М(>К}ЯО Tr,!(Г }Of>ril., НОГО ЭЛРКТРОД«а, За КЛ>О:«а«ОЩ«»!C =" . <>!» тlто В р(а К1Л "Г)71 (««««» я - ;= :-"т -, j r CH;lб; .i;. -—

Ну(О КИ(". «}Ороднi ii T Э j; Кт!>.-Ь«;-О:т, f- г«,OE.—

LrTB1от сУбстРат и tP.>(10 . и !}ил}(7>о— графи !0<1(<1(7>с "Iic-гр:.:!.;. !-.. Jl=м<-н(::Iи=КО НЦ Е (3 т 7««а (! (3 Гl К I C JIÎ PO I i(I ° I i О. j <) TP Lf i! i > l l c: " льное BJ(I v Tff!(Jñ TII <(>ер»ъ(е((;Р

Од}(а.(<о 1.. Т-польз(Бап-;(: э-:" "о cli-.< ::-ба Ограl ни е Ho !1(з(1! 70 и(«".::: (з(" 10 н а . 1"

НЬП(И P(BB!;J--.(H;(i», ((С;1! .(-;;; >1-П, > }О->Ям..С; ив«»(ЕН(««! .; П;!;,. О«(Ц«»; --i»,->, «! « „. - ° -;((;>О т.,;

Иаиб(>."ip бл(;"к; ".: .; .(!10-,. с техн(>чесiтс и су:.Н.О< I -,: .с . ;: ":а

CQ(. ОПрсд(-ЛЕПИЯ c!", Jl,f,« >O: Ti! >,(10>>Ã:1 пической янро<>осфатаз(,! !«; т; 1 Овв:.-дЕНИя фЕ!. :1(НтатИВН()ii О.(аKLII И С Пиров фоофатОМ Б ПР»!(СУТC . ««jr: О-«<-,т;

И 0 L«НОБрс("Е Н}10:. O (1 ЗМ(r}> ..(!1: Я 1!O, . .(i

".1 аЛа М ""-ЧуВСТБИ- Р««Ь=(-От-;, О г;; К-р-..7»

С TIQC JIFH! <«}(rc!!H cc ГЭП! Р3 С TiP }i .ТРМ Bc Ттl r«}3< >:

ТИ ПО КаЛиб! «ОБО«1}(<;й К р(i вой P а В!I C« мости o T величины ТТо Tснц1(ала v JIH nc объему добавляемо 0 .—.Ирофосфатc> «рп поддер(((анни потенциала влек тропа на постоянном уровне.

Магний, ионы которого прису -.(.тв;,ют в реакционной cp=-7 ет Б ÄqBIJII<(о». случае гомимо активаторной Ь ;(кц if! выполняет также роль индикатора, Сам метод основа}! 7!а 3HB«IHTельнс(1 различии средства индикаторных ионов к субстрату и продукту ферментативной реакции. По измененн:о концентрации иона-индикатора, измеряя потенциал соответствующего электрода, судят о скорости реакции, (.е. определяют активность фермента.

Определение активности фермент-., может быть осуществлено с помощь .о

" -:!!! :i -. >Я < - тг)й K«C>ИВОЙ r I!BХОДЯ ПО }3(»H

3! 3 B -I « . Н Vi <= ri С К ОМО и ° В!c JI И Ч И НЫ Н Е Г! О С р ЕД с т !о с;- н > в 3 B 3 иr им О - т и О т 3 с ли ч и «! ы

7!т> f;!Tv: —;;:1, . —.1(бо измерением объема

«f;!«Orj> "r r« : rIr б 1,! т li !1 O (ОЕцу тт:Ь!О П<ат(ЦОРжа-!ИЯ l!0TÅÒ ЦIIBËB -!ОСТОЯ Н >(ЬТ":< .-> г 073С(- ТатКО 1 I!.!ВЕС : НОГО СПОСоба

ЛВJI -:<-, : ; ТО т "1 О Оl-" „ >BЕ T БО I!POHЗ

« O. r«rj . f-T(- f»f- ., » „j«> Bты i TH!7(!» Б ОГРани ! !> . «-7".-«Т !OT. 00 1(!CТT«i Значp!3ИЙ КОН (ЕНтр цИЙ субстра B и ., онo.=! (о}(! f conTBeTQTБенно 0«0«-й> 5 и 0>1 !«(М) 7 которые обеспечивают изменение потенциала зл к.-рода не менее leJ; на» мБ для о ас !e«!(>пил оочности измерения 1ОЪ.

Треб емое концентрации металла-ин1!(!Ка "ОРа ((Е ЯБЛ ЯЮТС Я ОПТИ(lа Чт=.НЫМИ ДЛЯ ак °;Ii;Io(;TT- нсоргани< есной п,рофос-! Та >3! >, .", (: < и Иr(c=.. " "ТУT>(ТВIТ «Г

< 1

:r; Lir.:!; т:-:,". 7 (:110006B 1«вляе TC.I:-".el«inc TB- .70 («I °; f-f (СО>7;а j в <Т 1«>r! Тт, (òÐH «= . О HC— — cT TÎ огса!ТИ-!ИВ аЕт ВСЗ— c3r;,г "..:, t О 1«РИ!. . f!07!HЯ l(:l ... .. i)PТСН11 1 0,71!}}: -;VÐ .ОЧ

7 - (. г» i> «Е!«Г }Tfi ! (» — —,— «т;Н((ая 1-- «(Ь;.- . "т 717-а«»т< я ТЕМ тто с(1 .. -:-:10 . . ог«обу (:пт>",Tòp;«å-:ия ак-„,>:,, -г>. т. : !!CO;> T(IH«Jpr-(Oй Пиро J>,côBTB:;«!

" О«1!Та .: 3770 Роет;ПИ; (1 !ИРО >OCQB"«-*. —,- .:«-«-.; -;:ВГ"!.Б «.- II cT :> f,- r . H О,Т«1«г, > (;.1 (! 1 1 B», «-.>(;7;-i- T(r> TO» }IT! TTBJTB Ка . (7«(«(3 < > : "(77(37 И» HG 0;>.,1.«т в 0О >,а c JIO» с .«.> -;(,-,В«, (г>К;((т « -тт;г-.т>г«7«г»77;.т °;, г}т(-(И>«Ног ТИ к, i l! =,р(>з;.-. «7>сй (г; -, .i! !7 з!!Бисимо<:—

О(! Г>О :.,}77.-.:: —,. "ОТО((: ..:Ппа ИЛ:-; ПО

>0.1 -..! «= !- 1 <". i; 1>r! : Ос<«с- та при

;;;1(-.((И(-(;:о(о — лс:(трода на, r> iO . ..:1, . К3

+)

« -««, вт 1 ИРП,Л ° т К 1 (!r

« (> (1 Г Дс,!О

:. ан..: ..: —: . с! !71(а "jf. l .;:."- Оп(чувствитг -1.: 7 О-::. -.". « тоода (JB Бет(ич-.".:-;у пре!.7-1! а;.:-1;г", :. (!.:-:ОЗМО:;f!O РИ ВЬТСОКОЙ

; —,arc -::..:1(}1>-,l —;,!Е TB.—,J!.->.— О

ПО=: .-.;! r!r >О;ЫСИтЬ ТС .- .. ТЬ ОПРЕДЕ—;-:;;«7i-; (.,-,"1-, Ir,;-,!!Он, т

ЮО(.:: "":- ....:. ЕНЕН (Я С!!OCOGB.

Tc>". .!vl Р! Р 3ОМ * В:1! . Ci J« «7 ДЗ-Я ОП .-:е влн(х, lllf" на фер«-;е!-:та.ти Б}lóio реак-! т!!Ю > !jQ -.,"C, >L!j-. pr pri 3 С: СрОДС тВО К убстр-!.T J:: п-.-одукту. Поско.г..ьку ! б,! Ст/б>с т!оат i-,>«r* : " TT B(т 10 -i CLI+ с иль нее

}I«:O;I"JK l r В ХО»Д>Е .IET31«BHTc: T IВНОЙ рсil;(:,:и хонцентра(,и(-. Ко:(:ов Cui уве-!!Ич((в естci! . Jo изме -"нию концентрации

HOHB i >, « - !Î> ;}10 C;TПИ.!.Ь 0 CKCPOC Tl»

;17,(Е; т>1. >; , 1 49545 тивности фермента. Для этого регистрируюФ кривую изменения потенциала катиончувствительного электрода в ходе ферментативной реакции либо с помощью специального устройства поддерживают постоянную кон5 центрацию иона Си ?, добавляя субстрат.

В первом случае аппаратурное оформление проще, но для определения активности нужно использовать калибровочную кривую. Во втором варианте активность фермента измеряется непосредственно, поэтому он является более чувствительным.

Кроме того, предлагаемый способ позволяет проводить измерения в не- 15 прерывном режиме и не приводит к уничтожению ферментативного матери- . ала. Перспективным .представляется использование метода для непрерывного измерения активности ферментов, иммобилизованных. на тверДых носителях, и ферментов, субстраты которых не имеют хромофорных групп и не могут быть определены спектрофотометрическим методом. Использование метода может обеспечить достижение положительного эффекта в определении содержания фермента в биологических культурах и разработке. способов получения высокоочищенного фермента.

Пример 1. Прибавляют неорганическую пирофосфатазу к раство.ру, содержащему пирофосфат натрия (1 ммоль),хлористый магний(1,5 ммоль) трисовый буфер (рН 7,2) и сернокислую

} едь (10 мкмоль). В ходе ферментатив-35 ной реакции происходит гидролиз пирофосфата до фосфата. Так как ионы

Cd> дают более прочный комплекс с пирофосфатом по сравнению с фосфатом, их концентрация увеличивается. С по- 4() мощью милливольтметра в ходе реакции регистрируют изменение потенциала катиончувствительного электрода (модель F 3002, фирма РадиоМеТер, алания). ХаРактеристика Ка 45 либровочной кривой приведена втабл.1.

Таблица 1

Таблица 2

Скорость прибавления субстрата, мкмоль/мин (активность, Е/10 мл) Концентрация хлористого магния, ммоль 0,69

0,3

0,72

1,2

2,4

0,70

Различия в активностях в двух идентичных опытах при указанных ,концентрациях хлористого магния cd50 ставляет 3-9%.. Минимальная концентрация фермента, вызывающая прибав ление субстрата при концентрации хлористого магния 0,6 ммоль, составляет 0,05 мкг/10 мл.

55 Технико-экономическая эффективность предлагаемого способа заключается в повышении точности и воэможности более широкого применения его для определения ферментативной активности по сравнению с изнестным способом, а также н простоте определения, 0,78

1,62

0,54

0,92

2,1

1,44

4,02

2,52

8 Тираж 523 Подписное г.ужгород,ул.Проектная,4

Филиал ППП "Патент", Различия в скорбстях изменения потенциала в двух идентичных опытах при указанных активностях фермента

ВИИИПИ Заказ 8361/2 составляют 5-8%. Минимальная концентрация фермента, вызывающая изменение потенциала катиончувствительного электрода, составляет

0,09 Е/10 мл.

При определении активности неорганической пирофосфатазы в растворе, полученном при ее очистке ионообменной хроматографией, скорость изменения потенциала составляет

1,2? мВ/мин. Следовательно, актив; ность фермента равняется 1,95 E/10 мл

Известный метод $2) дает значение

1,7 E/10 мл при ошибке определения

18%.

Пример 2. Способ осущестнляется согласно примеру 1 с концентрацией сернокислой меди 1 мкмоль, концентрацией фермента 1 25 мкг/10 мл пирофосфата натрия 0,3 ммоль и переменной концентрацией хлористого магния, но изменение потенциала катиончувствительного электрода используют для приведения в действие установки рН-стат, которая антоматически поддерживает потенциал, а следовательно, и концентрацию ионов

Cu+2, непрерывно прибавляя пирофосфат натрия взамен гидролиэованного.

Результаты измерений приведены в табл.2.