Способ определения фаголизосомальных структур клетки

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЛИЗОСОМАЛЬНЫХ СТРУКТУР КЛЕТКИ дутем инкубации фагоцитов и фагоцитируемых частиц последующего цитохимическо го выявления кислой фосфатаэы и электронного микроскопического исследования внутриклеточных структур, отличающийся Teiyi,. что, с целью повышения чувствительности способа, интактные фагоциты инкубируют в среде, содержащей буферный раствор с рН 7,0-7,2 5-15 мм /) -глицерофосфата и 2-5 мМ нитрата свинца. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И) ГССУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬ1ТИЙ т;.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ.

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21 ) 3438512/28-13 (22) 06.05.32 (46) 23.03.84, Бюл. М 11 (72) A.Â.Õðàìöoâ и В.М.Земсков (71) Научно-исследовательский институт иммунологии АИН СССР (53) 612.112.3(088.8) (56) 1. МиТ?ег, W.À., Steinman R.M.

Cohn Z.À. The membrane proteins

of the vacuoIar system,II BidirectionaI fIow between secondary Iysosmes

and pIasma membrane - "CeII BioIogy", 86, 1980, р. 304-314.

2. SegaI А,W. Doriing J Coade S.

Kinetics of fusion of the cytopIasmic granuIes witg phagocytic vacuoIes in human poIymorphonucIear

Ieukocytes> CeII BioIogy", 85, 1980, р.42-59 (прототип). (54)(57.) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЛИЗОСОМАЛЬНЫХ СТРУКТУР КЛЕТКИ путем инкубации фагоцитов и фагоцитируемых частиц, последующего цитохимическо-! го выявления кислой фосфатаэы и электронного микроскопического исследования внутриклеточных структур, отличающийся тем,. что, с целью повышения чувствительности способа, интактные фагоциты инкубируют в среде, содержащей буферный раствор с рН 7,0-7,2 5-15 мм /3 -глицерофосфата и 2-5 мМ нитрата свинца.

1081542

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской цитохимии и может быть использовано для оценки свойств внутриклеточных структур.

Известен ультрамикроскопический способ определения фаголизосомальных структур клеток путем выделения последних и культивирования в системе <п yi4pa в течение нескольких суток с добавлением в инкубационную среду либо- коллоидного золота, ли- 10 бо торотраста(1) .

Известен также способ, включающий получение клеток, фиксирование их раствором какого-либо альдегида, замораживание„ криомикротомирова- 15 ние с проведением на заключительных этапах цитохимической реакции при РН 5,0 на лизосомальный фермент кислую фосфатазу с Р -глицерофосфатом в качестве субстрата и ионами свинца в качестве контрастирующего агента P) .

Недостатком известного способа является то, что предварительная альдегидная фиксация подавляет активность кислой фасфатазы, что препятствует достаточно полному выявлению фермента и значительно снижает чувствительность известного сйособа, B процессе фиксации изменяется проницаемость биологических мембран, что может приводить к диффузии фермента и определению мест его неистинной локализации. В процессе замораживания перед криомикротомированием происходят значительные по.вреждения клеток.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения фа- 40 голизосомальных структур клетки путем инкубации фагоцитов и фагоцитируемых частиц, последующего цитохимического выявления кислой фосфатазы и электронного микроскопического 45 исследования внутриклеточных структур, интактные фагоциты инкубируют в среде, содержащей буферный раствор с РН 7,0-7,2 5-15 мМ -глицерофосфата и 2-5 мМ нитрата свинца.

Способ осуществляется следующим образом.

Полученные фагоцитирующие клетки в конечной концентрации 1 10 3 .106/мл вносятся в содержащую фагоцитируемый материал инкубационную55 среду следующего состава: 120-160 мМ хлорид натрия; 3-7 мМ хлорид калия, 15-25 мМ НЕреэ, 3-7 мМ глюкоза, 5-15 мМ р -глицерофосфат и 2-5 мМ нитрат свинца, имеющую РН 7,0-7,2. 60

После инкубации в течение 15-60 мин клетки осаждают центрифугированием, фиксируют 4Ъ-ным раствором параформ-. альдегида, постфиксируют 1Ъ-ным растВором четырехокиси осмия, обезво-65 живают ацетоном с возрастающей кон- . центрацией последнего от 70 до 100Ъ, заливают в смесь эпон-эралдит, полимеризуют .в течение 48-60 ч, ультрамикротомируют и изучают в электронном микроскопе.

Пример. Фагоциты получают промыванием брюшной полости мышей

СВЧ Нерест — забуференной средой, содержащей 140 мМ йа CP ", 5 мМ КС1, 20 глМ Йере 5 (РН 7,2), 5 мМ глюкозы, кроме того, на 250 мл.этого раствора вносят 50 мг бычьего сывороточного альбумина и 5000 ед. гепарина. Клетки осаждают центрифугированием в течение 8 мин при 1200 об/мин на холоду. После этого осадок ресуспензируют в не ей — забуференной среде с 0,2Ъ-ным бычьим сывороточ ным альбумином и вновь центрифугируют при тех же режимах. Полученные клетки инкубируют в НЕреб — забуференной среде, содержащей также

10 мМ (-глицерофосфат и 3,6 мМ

pQ (НО >) < котоРУю фильтруют перед использованием. В качестве фагоцитируемого материала используют частицы латекса, количество клеток в инкубационной среде составляет

1 10 /мл. Время инкубации 30 мин на водяной бане при 37 С и постоян ном встряхивании (амплитуда 2, частота 10п чегзаР @baker 1 ре 327 °

Фагоцитоз останавливают добавлением в среду инкубации раствора пара.формальдегида на 10 мМ какодилатном буфере (конечная концентрация параформальдегида 1,5Ъ . Клетки осаждают центрифугированием(3000 об/мин в течение 10 мин при 4 С, фиксируют в

4Ъ-ном растворе параформальдегида на 100 мМ какодилатном буфере РН 7,2},.â течение 3-х ч, постфиксируют 1 Ъ-ным раствором четырехокиси осмия на 75 мМ какодилатном буфере в течение 3 -х ч, обезвожи ают в возрастающем ряду ацетона (70-100Ъ), заливают в смесь эпон-аралдит, полимеризуют течение 48 ч. Ультратонкие срезы получают на ультрамикротоме фирме Eked (Швеция Материал просматривают в электронных микроскопах

JE1IA — 100 Сх, ЗЕМ -7A (" 7eoB", Япония) при ускоряющем напряжении

60 кВ.

В некоторых фагосомах макрофагов наблюдаются электронно-плотные осадки фосфата свинца. Следовательно, такие структуры представляют собой уже не фагосому, слившуюся с лизосомой, т.е. фаголизосому.

Пример 2. То же, что и пример 1, за исключением того, что

1в среду инкубации вводят 4 мМ

Р-глицерофосфата. Осадок прн просмотре в электронном микроскопе не обнаруживается из-за его недостаточности.

1081542

Составитель Л.Емельяненко

Техред Л.Микеш Корректор Г. Решетник

Редактор Л.Гратилло

Заказ 1540/39 Тираж 823 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная. 4

Пример 3. То же, что и пример 1, за исключением того, что в среду инкубации вводят 16 мМ д -глицерофосфата. Осадок при просмотре в электронном микроскопе носит неспецифический характер — общий фон поля темный.

Пример 4. То же, что и при-. мер 1, за исключением того, что в среду инкубации вводят 1 мМ нитратасвинца. Осадок при просмотре в элект-10 ронном микроскопе не обнаруживается из-за его недостаточности.

Пример 5. То же, что и пример 1, за исключением того, что в среду инкубации вводят 6 мМ нитрата .15 свинца. Осадок при просмотре в электронном микроскопе носит неспецифический характекр — общий фон поля темный, кроме того, наблюдается гибель клеток из-за токсичности в таких кон-,, центрациях солей свинца.

Предлагаемый способ позволяет проводить исследований на клетках, не подвергающихся предварительно длительному культивированию в системе . и1юи регистрировать процесс..слия"ния фагосом не только с вторичными

Р а с первичными и вторичными лизосомами, а также дает воэможность определять фаголизосомальные структуры на субклеточном уровне и значительно сниженной трудоемкостью.