Способ получения тканевого аллергена для диагностики аутоаллергических процессов при хроническом тонзиллите

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ -ТКАНЕВОГО AJDlEPrEHA ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ АУТОАЛЛЕРГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ТОНЗИЛЛИТЕ, включающий гомогенизацию ткани 1и1индсшин человека, о тличающийся тем, что, с целью повышения специфической активности аллергена, полученный после гомогенизации осадок промывают физиологическим раствором и обрабатывают 1 н. раствором соляной кислоты при нагревании, отделяют насадочную жидкость, далее нейтрализуют ее раствором щелочи, стерилизуют и лиофилизируют.

(19) (11)

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3(51) A 61 К 39 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3480111/28-13 (22) 17 06.82 (46) 07.04.84. Бюл . 9 13 (72) В.Д.Яковенко, A.Ä.Базавлук, Г.П.Черкас, И.Л.Дикий, В.Ф.Филатов и H.È.Ãëàäêèé (71) Харьковский научно-исследовательский институт микробиологии, вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова (53) 615.361.46 (088.8) (56) 1. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1961, У 4, с.50-53.

2. Журнал ушных, носовых и горловых болезней, 1969, В 4, с.34-38. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТКАНЕВОГО

АЛЛЕРГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ АУТОАЛ—

ЛЕРГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ТОНЗИЛЛИТЕ, включающий гомогенизацию ткани миндалин человека, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения специфической активности аллергена, полученный после гомогениэации осадок промывают физиологическим раствором и обрабатыва- ют 1 н. раствором соляной кислоты при нагревании, отделяют насадочную жидкость, далее нейтрализуют ее раствором щелочи, стерилизуют и лиофилиэируют. (.084025

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения тнаневого аллергена для диа1ностики аутоаллергических процессов при хроническом тонзиллите.

Известен способ получения тканеного аллергена для диагностики аутоаллергических процессов при хроническом тонзиллите путем гомогениэации ткани миндалин человека с последующим отделением надосадочной жидкос- О ти, используемой затем н качестве аллергена (;1).

Недостатком данного способа является невысокая специфическая активность получаемого аллергена, что 15 затрудняет аллергоциагностику хронического тонэиллита.

Известен способ получения тканево" го аллергона для диагностики аутолаллергических процессов при хроническом тонэиллите, включающий гомогенизацию ткани миндалин человекаГ2).

Недостатком указанного способа является низкая специфическая актинности аллергена (аллергические реак- >5 ции при определении in vitro положительны у 38% здоровых людей и у

76% больных хроническим тонэиллитом) .

Цель изобретения — повышение специфической активности аллергена.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения тканевого аллергена для диагностики аутоаллергических процессов при хроническом тонзиллите, включающему гомогенизацию ткани миндалин человека, полученный после гомогенизации осадок промывают физиологическим раствором и обрабатывают 1 н. раствором соляной кислоты при нагре- 40 ванин, отделяют надосадочную жидкость, далее нейтрализуют ее раствором щелочи, стерилизуют и лиофилиэируют.

Способ осуществляется следующим образом.

Удаленные во время оперативных вмешательств небные миндалины отмывают физиологическим раствором хлори да натрия, взвешивают и измельчают в блендоре в присутствии 15 мл физиологического раствора хлорида натрия в течение 10 мин при 3000 об/мин.

Полученный гомогенат центрифугируют

5 мин при 1000 об/мин. Осадок трижды отмывают при центрифугировании избытком физиологического раствора. Режим центрифугирования 5 мин 1000 об/мин.

Полученный осадок отжимают между листами фильтровальной бумаги

Полученный осадок гомогената мин- 6О далин подвергают кислотному гидролизу 1 н. раствором соляной кислоты из расчета 200 мл 1 н. НС1 на 4 r влажной массы осадка. Гидролиз ведут в течение 30 мин при кипячении.„ 65

Сухой остаток

Нелетучие соли

Пептиды

Редуцирующие моносахара

Аминокислоты Следы

Соли жирных Следы кислот

Нуклеотиды Следы

Олигосахариды 9,40

Аминный азот 0,012

Средний молекулярный нес. 5000 уе.

Основу биологически активного начала аллергодиагностикума составляют олигосахариды, представленные в ткани миндалин в составе соединительнотканных и ретикулярных волокон.

Последнее объясняет высокую диагностическую ценность полученного аллергена и дает возможность его химической идентификации.

13,60

3,60

0,40

0,20

Гидролиэат охлаждают до 20 С, после чего нейтрализуют 1 н. раствором .гидроксида натрия (ИаОН) под потенциометрическим контролем до рН 7,1.

Нейтрализованный продукт центрифугируют в течение 30 мин при

8000 об/мин. Осадок отбрасывают.

1 мл надосадочной жидкости упаривают досуха под вакуумом при 10 мм рт. ст. и 50 С до постоянного веса.

Производят взвешивание.с Затем сжигают навеску в муфельной печи при о

800 С и повторно взвешивают. Содержание органических веществ определяют по разности результатов перного и второго взвешивания.

Исходя из полученных результатов весоных определений, аллерген стандартиэуют по навеске органических веществ до значений 10 мг/мл, проводя в зависимости от результатов упаривание в условиях вакуума при 10 мм рт.ст. и 40 С или разведение физиологическим раствором хлорида натрия.

В полученном аллергене повторно определяют количество органических веществ.

Полученный стандартный раствор аллергена подвергают стерилизующей фильтрации через фкльтр Зейтца. . Раствор аллергена н стерильных условиях разливают в стерильные ампулы из нейтрального стекла объемом 3 мл и лиофилиэируют при следующем режиме: вакуум 0,2 мм рт.ст.

Т 20ОС;.время йиофилизации 17 ч; время досушивания при комнатной температуре 6 ч.

Полученный при лиофилизации аллерген представляет собой белый порошок, гигроскопичный и легкорастворимый в воде.

Полученный по предлагаемому спое собу аллерген имеет следующий химический состав (расчет содержания в

1 мл), мг:

3 1084025 4

С учетом химического родства полученного аллергодиагностикума гепарину для идентификации предлагается метод определения тлерантности плазмы к гепарину. Опыт проводят путем сравнения биологической актив- 5 ности гепарина и полученного аллергодиагностикума с использованием общего контроля, предусмотренного методикой. Результаты сравнительных исследований трех серий полученного 10 аллергодиагностикума однозначно показали, что он обладает антикоагуляционной активностью, уступая тем не менее гепарину (90Ъ активности от гепарина) . Предлагаемый метод идентификации надежен, легко понторим, методически прост, доступен для использования в любых условиях.

Активность аллергена, полученного по предлагаемому способу, изучена в опытах in vitro по тесту ППН (показатель повреждения нейтрофилов), который нашел весЬма широкое применение в клинике и лабораториях как

1 метод аллергодиагностики, имеющий преимущество перед внутрикожными пробами (полная безопасность, более высокая чувствительность, отсутствие противопоказаний) .

Аллергодиагностике были подверг- 30 нуты 58 больных хроническим тонзиллитом и 20 здоровых людей (контроль)-.

Для постановки реакции ППН использованы 3 серии аллергена, изготовленного по предлагаемому способу и 3 35 серии аллергена, полученного по способу-прототипу.

Стерильный пипеткой в 3 стерильные видалевские пробирки вносят по 40

0,08,мл свежей несвернувшейся крови.

В одну из этих пробирок, служащую опытом, вносят 0,02 мл изучаемого тканевого аллергена, в другую— такое же количество известного аллергена, полученного по способу- 4> прототипу.

Аллергены для постановки реакции

ППН разводили следующим образом:

1,0 мл жидкого аллергена (концентрации 100 мг Ъ) смешивали с 0,25 мл

25%-ного раствора цитрата натрия.

При этом конечная концентрация антикоагулянта в аллергене составляла 5оо. В третью, контрольную пробирку добавляли 0,02 мл 5% цитрата натрия. После инкубации пробирок в течение 2 ч в термостате (37 С) из каждйй:.пробирки готовили мазки, высушивали на воздухе, фиксировали, обрабатывали по Шабадашу и окрашивали гематоксилином в течение 5 мин.

Для оценки теста ППН просматри-. вали 100 нейтрофилов в контрольном и опытных мазках. Результаты подсчета обрабатывали по формуле

Н„ Н2

100 где Н вЂ” число поврежденных нейтрофилов в опыте;

Н1- число поврежденных нейтрофилов в контроле;

100 — количество просмотренных в мазке клеток.

Данные опытов представлены в таблице.

Испытание in vitro в тесте ППН полученного по предлагаемому способу аллергена с кровью здоровых и больных компенсированным и декомпенсированным хроническим тонэиллитом показали его высокую диагностичес- кую активность (абсолютные значения теста ППН превышали данные прототипа при компенсированном тонзиллите в среднем в 2,3 раза и при декомпенсированном хроническом тонэиллите — в 2,7 раза.

Наличие достоверных отличий в диагностических показателях теста

ППН при компенсированном хроническом тоизиллите и декомпенсированном хроническом тонзиллите позволяет проводить дифференциальную диагностику форм хронических тонзиллитов и определять соответствующие методы лечения. с

Предложенный способ методически прост, доступен и экономически выгоден (не требует дорогостоящих. реактивов, обррудования и больших затрат рабочей силы и времени).

1084025

Форма заболевания !

Разница

Результаты опытов с аллергеном

Р,%

Число обследованных

Серия антигена предлагаемым Со 1

10

Составитель Л.Малышева р дактор М,Дылын Техред T.Äóáèí÷àê Корректор A.Тяско

Заказ 1853/5 Тираж 688 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Рауыская наб., д.4/5

Хронический компенсированный тонзиллит

Хронический декомпенсированный тонзиллит

Контроль (здоровые люди) О, 185+0,042 О, 076+0, 023 О, К@9 > 95

0,162+0, 041 О, 069+0, 027 0,093 « У 95

0,173+0,053 0, 085+0,030 0,098 > 95

0,342+0,065 0,110 0,033 0,232 >-95

0,292+0,069 0,137+0,025 0,155 у 95

0i309$0i083 0,105 0,024 0,204 У 95

Ок025+0 ° 002 Ок032+Oю003 Ок007 У 95

0,027+0,004 0,038+0,005 0,011 У 95

0,048+0,006 0,045+0,004 0,003,У 95

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4