Способ йодирования клеток

 

СПОСОБ ЙСдаРОВАНИЯ ЮТЕТОК путем инкубации их в присутствии радиойода и клорамина Т, отличающийся тем, что, с целью повьппения выхода жизнеспособных лимфоидных клеток, инкубацию клеток в концентрации

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3(59 07 С 103 52 (21) 343 9295/28-13 (22) 14.05.82 (46) 07.04.84. Бюл.%13 (72) Т.А. Серова и Я.А. Соколов (71) Московский научно-исследовате-. льский институт вакцин и сывороток им. Н.И. Мечникова (53) 615.375(088.8) (56) 1. Hunter M. et ай. Natur (London), 1962, 194, р.495.

„SU„„1084272 А (54)(57) СПОСОБ ИОДИРОВАНИЯ КЛЕТОК путем инкубации их в присутствии радиойода и хлорамина Т, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода жизнеспособнык лимфоидных клеток, инкубацию клеток в концентрации (0,5-3,0)х108 Кл/мл осуществляют с радиойодом в соотношении (2-6)х10 Кл/мКи, а с хлорами8 ном Т в соотношении (0,25-1,70)х

z10 Кл/мкг при концентрации хлорамина Т менее 200 мкг/мл.

72 2 т.е. к уменьшению жизнеспособности пройодированных лимфоцитов.

С целью получения радиойодированных лимфоцитов с предельно высокими показателями жизнеспособности (падение жизнеспособности в результате реакции менее 37) для использования в реакциях клеточного иммунитета ин-виво и ин-витро применяют реакционное соотношение концентраций клеток к радиойоду, равное 4х10 Кл/мКп, и соотношение в концентраций клеток к хлорамину

Т, равное 1,6х10 Кл/мкг.

Для достижения максимальной чувствительности в исследованиях с при менением полученных меченых лимфоцитов ин-вино и ин-внтро путем предельно высоко эффективного йодирования и высокого насыщения клеток йодом (при условии падения жизнеспособности клеток в результате реакции не более чем на 107) необходимо использовать иммунологически активированные лимфоциты при отношении их концентрации к концентрации клеток, к концентрации хлорамина .

Т равном 0,56х106Кл/мкг.

Пример 1. Йодирование лимфоцитов с максимальным сохранением их жизнеспособности.

В реакционную пробирку последовательно вносят 0,3 мл клеточной суспенэии лимфоцитов в растворе Хенкса с реакционной концентрацией

1, 9х108Кл/мл, 0,01. мл радиойода— f25 .(1/ 2 мКи) 0,1 мл хлорамина Т с реакционной концентрацией 116 мкг/мл

Инкубацию выполняют в течение

30 с при умеренном встряхивании.. Реакцию останавливают добавлением

5 мл холодного раствора Хенкса

+4 С и отмывают их 3 раза тем же раствором от непрореагировавшего радиойода центрифугированием клеток в течение 10 мин при 800 об/мин (120 ). Эффективность йодирования при этом не более 207, .а жизнеспособность клеток снижается не более чем на 27..

Пример 2. Йодирование клеток с максимальной эффективностью реакции мечения и с максимальным насыщением клеток радиойодом.

Заблаговременно выполняют стандартную активацию лимфоцитов иммунологическим методом. Например, вводят за 2 недели до йодировання подопытным животным (мышам) по бх109

1. 10842

Изобретение относится к прикладной иммунологии, преимущественно к получению меченых йодированных клеток, и может быть использовано при проведении иммунологических исследований.

Известен способ йодирования белковых структур клеточной стенки посредством хлораминового йодирования белков Е13.

Однако этот способ не позволяет получить меченые лимфоидные клетки с высокой степенью жизнеспособности (выход жизнеспособных клеток 257).

Целью изобретения является повышение выхода жизнеспособных лимфоидных клеток.

Укаэанная цель достигается тем, что согласно способу йодирования клеток путем инкубации клеток в присутствии радиойода и хлорамина Т, отличительной особенностью является то, что проводят инкубацию клеток в концентрации (8,5-3,0)х10 Кл/мл с радиойодом в соотношении (2-6)х х10 Кл/мКи, а с хлорамином Т в соотношении (0,25-1,?0)х106Кл/мкг при концентрации хлорамина Т менее

200 мкг/мл.

Способ выполняется следующим образом.

Мечение выполняют при реакционном соотношении концентраций клеток к хлорамину Т, равном (0,25-1,7)х х10 Кл/мкг, и при реакционном

6 соотношении концентраций клеток к радиойоду, равном (2-6)х10пКл/мКи причем при соблюдении указанных соотношений реакционная концентрация клеток должна находиться в диапазоне (0„5-3)х10 Кл/мл, а реакционная кон8 центрация хлорамина Т не должна,превьппать 200 мкг/мл. При этом насыщение лимйоцитов атомами йода подчиняется формуле

Х=-0,27+1,24У при R +0,97 и .

Р(0,01 (11 где Х вЂ” радионасыщенность лимфоцитов, выраженная в единицах (миллионы атомов йода/клетка, У вЂ” соотношение количество йода -50

125 в мкюри в реакционной смеси/количество клеток, выраженное в сотнях миллионов/мп реакционной смеси.

Формула (1) позволяет заранее рассчитать радионасыщенность лимфоци-55 тов в результате реакции. Известно, что черезмерное радионасыщение ведет к деградации меченого соединения, Таблица

Концентрация хлорамина . Т, мкг/мл

Жизнеспособность при времени инкубации, с

120 (j

600 1800

3,13

45,84 14,07

77,34 36,35

88,09 65,9

4000

69,33

86,73

13, 18

2000

94,09

1000

95, 04

57,2

90,69 78,94

500

78,7

94,07 90,7

96,69

200

П р и м е ч а н и е: Жизнеспособность лимфоидных клеток в начале инкубации принимают за 100Х.

3 1084 микробных тел коклюшной вакцины.

Этот адьювант и неспецифический модулятор иммунологической реактивности лимфоцитов приводит к существенному увеличению количества бел5 .ковых. рецепторов на поверхности лим-, фоцита. В день йодирования выделяют иммунологически активированные лимфо циты и готовят клеточную суспензию в растворе Хенкса. 1О

В реакционную пробирку последова-. тельно вносят 0,3 мл клеточной суспензии лимфоцитов в растворе

Хенкса с концентрацией 1, 12х tO Кл/мл

0,01 мл раствора йодистого натрия

1/2 мКи 0,1 мл раствора хлорамина

Т с реакционной .концентрацией

200 мкг/мл. Инкубацию проводят

30 с при умеренном встряхивании и далее останавливают добавлением

5 мл раствора Хенкса +4 С. Клетки отмывают от непрореагировавшего радиойода 3 раза раствором Хенкса и центрифугированием в течение

10 мин при 800 об/мин (120 ). Эффективность йодирования для активированных лимфоцитов в этих условиях составляет 50-653, а неактивированных лимфоцитов 40-50Х. Жиэнеспособt ность пройодированных клеток более 907..

В табл.? представлены данные по влиянию времени инкубации лимфоцитов с хлорамином Т на их жизнеспособность,,выраженную в единицах число живых клеток

35 в табл.2общее число клеток " данные по влиянию времени инкубации и концентрации лимфоидньи клеток на их жизнеспособность

272 4 в процессе инкубации с хлорамином

Т; в табл. 3 — эффективность йодирования1 лймфоидных клеток хлораминовым методом и их жизнеспособность по"окончании реакции.

Жизнеспособность лимфоцитов падает при инкубации с возрастающими концентрациями хлорамина Т(табл.1).

Динамика утраты жизнеспособности клетками становится круче при увеl личении концентрапии клеток до

Зх10 Кл/мл при стандартной кона центрации хлорамина Т (табл.2).

Полученные данные впервые доказывают, что хлораминовое йодирование позволяет при точно определенных условиях получить жизнеспособные лимфоциты, меченые йодом с высокой эффективностью. Жизнеспособность лимфоцитов оценивают во всех случаях общепринятым способом по исключению красителя.

Исходя из результатов исследований выполнена математическая оптимизация хлораминового йодирования лимфоцнтов путем линейной аппроксимации при следующих ограничениях: все зависимости представлены плоскостью, а не криволинейной поверхностью условия экстремума определяют только в области, ограниченной исследованными значениями реакционньм концентраций лимфоцитов, хлорамина Т, радиойода и времени реакции.

Таким образом, способ позволяет повысить выход жизнеспособных меченых лимфоидных клеток более чем в 3 раза при повышении эффективности йодирования клеток более, чем в 2 раза.

1084272.Таблица 2

Жизнеспособность при времени инкубации,C

Концентрация клеток кг/мл -10 1

240 360 600 1800

30 120

200

87,7

90,7

500

12,5

55,36

90,9

4,7

97,75 95,83 93,54 90, 1

65,67

П р и м е ч а н и е: Жизнеспособность лимфоидных клеток в начале инкубации принимали за 100Х; каждое цифровое значение представлено средним из трех экспериментов.

Таблица 3

Время реакции, с

Параметры реакции йодирования

120

600

Эффективность,X

4,8

Жизнеспособность,X 99

96,7

9,4

Эффективность,%

17,05

Жизнеспособность,X 98,2

91,4

Эффективность,X

37,85

34,85

Жизнеспособность,X 97,78

90,6

95,8

25,25

29, 05

78,89

25,8

Эффективность,X

Жизнеспособность,X 99,6?

87,73

54,33

48, 17

47,85

Эффективность,%

89,3

Жизнеспособность,X 96,1

90,1

42,4

79,9

43,69 45,66

71,55 27, 14

Эффективность,X

42,39

Жизнеспособность,7 87,84

Концентра ция хлорамина Т, мкг/мл

96,43 92,57

97,65 94,07

98,4 96,3

90, 78

94 07

79,4 72,43 65,96

87, 16 84,55 78,94

72,33

78, 89

80;37

36,44

1084272

Продолжение табл. 3

Время реакц»и, с

Вносимая активность!

1800

3600

Эффективность,3 6,55 7, 1 108

0,5

Жизнеспособность,й 85

82.

Эффективность, Й 7, 5

2х10

Жизнеспособность,3 84

Эффективность,Ж

29,95 28,92 2,8х10

150

0,5

Жизнеспособность,З 83

27,5

Эффективность,й

2б 4х10

200

Жизнеспдсобность,X 73 ЗЗ

65,56

Эффективность,Ж

46,65 1, 12х10

49,7

200

0,5

8

40, 7 1, 9х10

200

»»»»»«»»» 1 °

Жизнеспособность лимфоидных клеток в начале йодирования принимали за 100Х, каждое цифровое значение представлено средним значением из трех. экспериментов..

Примечание:

Составитель П. Бонарцев

Редактор Т. Веселова Техред T.ôäHTä Корректор A.Òÿñêî

Заказ 1919/18 Тираж 410 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и.открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Параметры реакции, йодирования

»»»»»»» \»»»»

Жизнеспособность, 3 75

Эффективность,й

Жизнеспособность,3

Концентрация клеток, ; Кл/мл

Концентрация хлорамина, мкг/мл