Способ определения кислородных радикалов,образуемых фагоцитами

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДНЫХ РАДИКАЛОВ, образуемых фагоцитами, включающий выделение клеток, смешивание их с фагоцитируемыми частицами, добавление соли тетразолия и инкубацию реакционной смеси с последуняцей регистрацией кислородных радикалов, отличающийся тем, что, с целью повышения его точности, в качестве контрастного вещества используют 150-250 мкМ тетранитросинего тетразолия, затем в ряд реакционных смесей дополнительно вводят супероксидцисмутазу от 1,1 мкг/мл до образования формазана, а количество кислородных радикалов (У) определяют по формуле (Л У -0,267 + 0,242Х, где X - количество супероксиддисмутазы , находящейся в пробе с образовавшимся формазансж, мкг/мл.

СОюэ СОВетсних

СОЦИАЛИСтИЧаСКИХ испуьлин

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ - .

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3474361/ 28-13 (22) 16.07.82 (46) 07.05.84. Бюл. У 17 (72) И.Б,Збарский, В.М.Земсков, И.А.Морозов, А .В.Пескин и А.В.Храмцов (71) Научно-исследовательский институт иммунологии АМН СССР, Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова и Институт питания АМН СССР (53) 611-018-53(088.8) (56) 1. Bors M., Saran М., Lengfelder Е., Michel С,, Fuchs С., Frenzel С. Detection of oxygen radicals

in biological reactions. Photochem.

Photobiol., 28, 1978, 629-639.

2. Park В.Н., Fikrig S.M., Smithwick Е.М. Infection and nitroblue

tetrazolium reduction by neutrophils.

Lancet, ii, 1968, 532. (19) (11)

С 01 0 33/48 А 61 В 10/00 (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДНЫХ РАДИКАЛОВ, образуемых фагоцитами, включающий выделение клеток, смешивание их с фагоцитируемыми частицами, добавление соли тетразолия и инкубацию реакционной смеси с последующей регистрацией кислородных радикалов, отличающийся тем, что, с целью повышения его точности, в качестве контрастного вещества используют 150-250 мкМ тетранитросинего тетразолия, затем в ряд реакционных смесей дополнительно вводят супероксиддисмутазу от 1, 1 мкг/мл до образования формазана, а количество кислородных радикалов (У) определяют по формуле

У = -0,267 + 0,242 ° Х, где Х вЂ” количество супероксиддисмутазы, находящейся в пробе с образовавшимся формазаном, мкг/мл.

1091070

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики иммунодефицитных заболева ний.

-Известны способы определения об- 5 разования кислородных радикалов путем использования маркировочного вещества, при взаимодействии которого с кислородными радикалами меняются спектральные характеристики 1 3, Однако чувствительность измерений указанным способом низка и позволяет регистрировать суммарно образование кислородных радикалов только от значительного количества клеток.

Известен также способ определения кислородных радикалов, образуемых фагоцитами, включающий выделение клеток, смешивание их с фагоци.тируемыми частицами, добавление соли тетразолия и инкубацию реакционной смеси с последующей регистрацией кислородных радикалов, для чего в суспензию, содержащую фагоциты и фагоцитируемый материал — дрожжевые клетки, одномоментно вводят нитросиний тетразолий и после инкубации материал просматривают в световой микроскоп.

По выпадении нерастворимого темноси-. него осадка определяют количество об-ЗО разовавшихся кислородных радикалов 2 3.

Однако нитросиний тетразолий является пригодным только для световой микросокпии, так как получаемый с результате его восстановления пРодукт 35 обладает слабой электронной плотностью.,Кроме того, способ на основе световой микросокпии является неточным, позволяет получить лишь данные о наличии или отсутствии продукта 40 реакции, не позволяет связать образование этого продукта (а следовательно, и кислородных радикалов) с определенными субклеточными образованиями, что черезвычайно важно для точно- 45 .ro описания места и момента выработки фагоцитом кислородных радикалов для диагностики иммунодефицитных заболеваний. !

Цель изобретения — повышение точности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определе- . ния кислородных радикалов, образуемых фагоцитами, включающему выделение клеток, смешивание их с фагоцитируемыми частицами, добавление соли тетразолия и инкубацию реакционной смеси с последующей регистрацией кислородных радикалов, при котором в качестве контрастного вещества используют 150-250 мкМ тетранитросинего тетразолия, затем в ряд реакционных смесей дополнительно вводят супероксиддисмутазу от

1, 1 мкг/мл до образования формазана, а количество кислородных радикалов (У) определяют по формуле

У = -0,267 + 0,242 Х, где Х вЂ” количество супероксиддисмутаэы, находящейся в пробе с образовавшимся формазаном, мкг/мл.

Способ осуществляют следующим образом.

Полученные фагоцитирующие клетки в конечной концентрации 1-10 —

3 ° 10 мл вносят в содержащую фагоци6 тируемый материал инкубационную среду следующего состава: 120"160 мй хлорида натрия 3-7 мМ хлорида калия, 15-25 мМ Н-(2-гидроксиэтил) -пиперазин-N-2-этаносульфоновой кислоты (HEPES), 3-7 мМ глюкозы, 150-250 мкМ тетранитросинено тетразолия, имеющую РН 7,0-7,2.

После инкубации в течение 15—

60 мин клетки осаждают центрифугированием, фиксируют 47.-ным раствором параформальдегида на 100 мМ какодилатном буфере, .постификсируют 17-ным раствором четырехокиси осмия на

75 мМ какодилатном буфере, обеэвоживают ацетоном с возрастающей концентрацией последнего от 70 до 1007, заливают в смесь эпон-аралдит., полимеризуют в течение 48-60 ч, ультрамикротомируют и изучают в электронном микроскопе.

Указанные величины .тетранитросинего тетразолия являются оптимальными, так как превышение верхних пределов может приводить к неспецифическоыу выпадению осадка, а нижние зна- чения являются теми минимальными количествами, которые достаточны для визуализации осадков в электронном микроскопе. Концентрационные значения хлорида натрия, хлорида калия, НЕРЕЯ и глюкозы являются минимально необходимыми для создания в среде инкубации условий для поддержания жизнедеятельности фагоцитов: изотоническое давление и рН.

В реакционную систему вводят разЛичные .количества супероксиддисмутазы.

Далее определяют концентрацию супер10910

Составитель Е.Житникова

ТехРед Ж,Кастелевич КоРРектоР В. Вутяга

Редактор Л.Филь

Заказ 3073/40 -Тираж 823 Подписное

„ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-.35-, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãîðîä, ул.Проектная., 4 оксиддисмутазы, при которой происходит образование диформазана, и по приведенной формуле рассчитывают количество кислородных радикалов, образуемых на субклеточном уровне. 5

Пример. Фагоциты, полученные стандартно из брюшной полости мьппей, инкубируют в НЕРЕЯ вЂ” забуференной среде,. содержащей, 140 мИ.NaCl

5 мИ KCl, 20 мИ HOPES (рН 7,2), 10

5 мМ глюкозы, 223 мкМ тетранитросинего тетразолия. В качестве фагоцитируемого материала, используют опсонизированные кроличьей антнсывороткой дрожжевые клетки Candida albicans. 1s

Время инкубации 30 мин при 37 С и постоянном встряхивании.

Для количественного определения кислородных радикалов на субклеточном уровне строят калибровочную кри- 20

t вую. В HEPS-забуференную среду вносят ксантин (2.10 4M) .и различные количества ксантиноксидаэы, что приводит к регистрируемым спектрофотометрически различным скоростям обра- 25 зования супероксидных анионов. Для каждой из скоростей образования экспериментально определяют различные величины их ингибирования определенными количествами супероксщ дисму- 30 тазы, после чего математически рассчитывают те количества супероксиддисмутазы, которые вызывают для каждого уровня образования супероксидт ных анионов максимальное ингибирова ние восстановления тетранитросинего

70 4

1гетразолия, детектируемое электронным микроскопом. В таком случае уравнение регрессии имеет следующий вид:

У = -0,267 + 0,242 Х (г=0,97)., где Х вЂ” количество супероксиддисмутазы, мкг/мл, У вЂ” количество кислородных радикалов, ммоль/мин. Вводя в среды иикубации, где содержатся фагоциты и фагоцитируемые частицы, различные. количества супероксидцис- ° мутазы, можно количественно определять кислородные радикалы на субклеточном уровне, Обработанные фагоциты полимеризуют в течение 48 ч при 60 С.

Ультратонкие срезы получают на ультрамгкротоме фирмы LKB (Швеция).

Материал просматривают в электронном микроскопе Н-300 ("Нь асЬх", Япония).

Результаты, получаемые с помощью предлагаемого способа отличаются высокой. точностью, что подтверждается отсутствием неспецифических осадков, отсутствием различий в многочисленных сериях опытов и большим обьемом проведенных экспериментальных исследований.

Предлагаемый способ позволяет более точно, на субклеточном уровне регистрировать образование кислородных радикалов, что необходимо для диагностики иммунодефицитных заболеваний. При этом расширяется область применения способа, поскольку описанные процедуры позволяют проводить исследования как в световом, так и в электронном микроскопе.