Способ получения искусственного гена интерферона @ 2 человека и способ получения полипептида с активностью интерферона микробиологическим синтезом
1. Способ получения искусственного гена интерферонаоС2 человека,, зак лючающийся в. том, что из мононуклеотидов фосфотриэфирным методом синтезируют олцгонуклеотиды длиной 9-15 звеньев, полученные олигонуклеотиды фосфорилируют с помощью полинуклеотидкина-зы, олигомеры ной сшивкой фрагментов 1-4 по липким длиной от 28 до 99 пар оснований, далее их клонируют плазмид:5ами рВ8. 322, pBR 322 Mpt 3 и pUR 222, N-концевую половину гена собирают последовательн сшивкой фрагментов 1.-4 по липким концам в составе векторной молекулы причем липкие концы сайтов Крп I и Ват HI удаляют ДНК-полимеразой I и S| -нуклеазой, а С-концевую половину гена собирают после клонирования одновременной сшивкой фрагментов 5-7 с определенной последовательностью нуклеотидов , затем две половины гена спшвают в полный искусственный геЯ интерферона оС 2 человека внутриили межмолекулярным способом. 2. Способ получения полипептида с активностью интерферона микробиологическим синтезом, включающим встройку искусственного гена интерферонасзС 2 челбвека в векторнз о плазмиду, нара ботку целевого продукта трансформированным микроорганиз ом н выдevП:eниe целевого .продукта, отличающ и и с я тем, что, с целью увеличения BbDcofta целевого продукта, при встройке искусственного, гена интерферона cL 2 человека используют лактозный оперон Е. coli в составе векторной , плазмиды а в качестве векторной плазмиды используют гибридную плазки .ду pLelF (plac) или pLelF-BI.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
09) (11) Зш С 12 " 15 oo
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н ABTQPCKOMY CBNQETESIbCTB Y
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОГКРЫТИЙ (21) 3493457/28-13 (22) 24.09.82 (46) 15.05.84. Бюл. 11 - 18 (72) М, Н. Колосов, В. Г. Коробко, В. Н, Добрынин, И. В. Северцова, С. А. Чувпило, Н. С. Быстров, .
10. А. Берлин, А. Л.. Каюшин, В. В. Буткус, И. А. Полякова, Е. Ф. Болдырева, Л. С. Сандахчиев, С. Г. Попов, Т, Н. Шубина, В. В. Кравченко, О. И. Серпинский, В. Ф. Ямщиков, С. И; Беликов, А. Н, Синяков и Г.Ф.Сиволобова (71) Институт биоорганической химии, им. N. N. Шемякина и Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (53) 578.085.1(088.8) (56) 1 ° Р. J. ВгЫяеп et al. Human
1утрЬоЬ1авйоЫ interfегоn. Large
scale production and partial purifi cation. - J. Biol. chem ., 1977, 65856587.
2, D. V. Goeddel et аl, Ншпап
leukocyte interfегоn produced Ьу E.
coli is biologically active. — Nature, 1980, 287,11 2, 411-415 (прототин). (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИСКУССТВЕННОГО
ГЕНА ИНТЕРФЕРОНА А 2 ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА С АКТИВНОСТЫО ИНТЕРФЕРОНА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ
СИНТЕЗОМ. (57) 1. Способ получения искусственного гена интерферона cL.2 человека,, з а к л ю ч а ю шийся в.том, что из мононуклеотидов фосфотриэфирным методом синтезируют олцгонуклеотиды длиной 9-15 звеньев, полученные олигонуклеотиды фосфорилируют с помощью полинуклеотидкиназы, олигомеры ной сшивкой фрагментов 1-4 по липким длиной от 28 до 99 пар оснований, да" лее их клонируют плазмидами рВЕ 322, pBR 322 мрс 3 и pHR 222, И-концевую половину гена собирают последовательно сшивкой фрагментов 1.-4 по липким концам в составе векторной молекулы причем липкие концы сайтов Kpn I u
Ham HI удаляют ДНК-полимеразой Т и
S -нуклеазой„ а С-концевую половину гена собирают после клонирования одновременной сшивкой фрагментов 5-7 с Е определенной последовательностью нук- )у у леотидов, затем две половины гена сшивают в полный искусственный геи интерферона K 2 человека внутри- или мекмолекулярным способом.
2, Способ получения полипептида с активностью ицтерферона микробиологическим синтезом, включающим встройку искусственного гена интерферона<А 2 человека в векторную плазмиду, наработку целевого продукта трансформи- а рованным микроорганизмом и выделение целевого .продукта, о т л и ч а ю ; шийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, при встройке искусственного гена интерферона d 2 человека используют лактозный оперон Е. coli в составе векторной.плазмиды, а в качестве векторной плазмиды используют гибридную плазми- ду pLeIP (plac) или pLeIP-BI, 109217б
Изобретение относится к биорганической химии, генетической инженерии и микробиологии.
Изобретение относится к получению искусственного гена интерферона о(2 человека, аналогов и прототипа этого э способа в литературе не обнаружено.
Изобретение касается также способа получения полипептида с активностью интерферона микробиологическим синтезом.
Известен способ получения полипептида с активностью интерферона, основанный на использовании лейкоцитов крови, которые Чтосле индукции вирусом 5 продуцируют интерферон (1).
Недостатками этого способа являются низкий выход продукта, высокая стоимость сырья и ограниченность его источников, что. определяет высокую стоимость препарата.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получе" ння полипептида, обладающего активностью ннтерферона, микробиологическим синтезом j2) .
Этот способ обеспечивает возможность получения продукта в больших количествах со сравнительно высоким выходом из дешевого исходного сырья, Однако недостатком данного способа является то, что копия гена из организма человека не является оптимальной для наработки кодируемого им по- З липептида в бактериальной клетке, поскольку первичная последовательность„ эукариотического гена содержит кодоны, характеризующиеся низким уровнем трансляции в бактериальной клетке, 40 что снижает выход продукта генетической экспрессии. Кроме того, копия природного .гена не приспособлена для создания штамма-продуцента, так как для ее использования требуется про- 45 ведение ряда перестроек первичной структуры с помощью методов генетической инженерии и химического синтеза.
Целью изобретения является полу- gg чение искусственного гена интерферона р(2 человека, а также увеличение выхода полипептида с активностью ин- ° .терферона.
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения искусственного гена интерферона N 2 человека при помощи фосфотриэфирного метода из мононуклеотидов синтезируют олигонуклеотиды длиной 9-15 звеньев, полученные олигонуклеотиды фосфорнлируют с помощью полинуклеотидкиназы, олигомеры сшивают ДНК-лигазой в 7 фрагментово длиной от 28 до 99 пар оснований, далее их клонируют плазмидами pBR 322, pBR 322 мрС 3 и
pUR 222, N-концевую половину гена собирают последовательной сшивкой фрагментов 1-4 по липким концам в составе векторной молекулы, причем липкие концы сайтов Kpn I и Вам HI удаляют. ДНК-полимеразой I u S -нук1 леазой, а С-концевую половину reна собирают после клонирования одновременной сшивкой фрагментов 5-7 с определенной последовательностью нуклеотидов, затем две половины гена сшивают в полный ген интерферона
d, 2 человека внутри- или межмолеку лярным способом.
Кроме того, согласно способу получения полипептида с активностью интерферона микробиологичееким син тезом путем встройки искусственного гена интерферона сК. 2 человека в векторную плазмиду, наработки целевого продукта трансформированным микроорганизмом и выделения целевого продукта при встройке искусственного гена интерферона оЕ 2 человека используют лактозный оперон Е. cori в составе векторной плазмиды, а в качестве векторной плазмиды используют гибридную плазм щу pLeIF (раас) или pLeIF-BI.
На фиг. 1 изображены аминокислотная и нуклеотидная последовательности интерферона и искусственного гена интерферона с 2 (отличия-от природной последовательности нуклеотндов в значащей цепи подчеркнуты); на фиг. 2— ! нуклеотидная последовательность синтетических фрагментов гена (знаками h указано разделение цепей фрагментов на олигонуклеотиды); на фиг. 3— схема сборки N-концевой половины гена (7-250) из фрагментов 1-4 путем последовательной сшивки фрагментов по липким концам в составе векторной молекулы с последующим удалением сайтов I 3 риант получения векторных плазмид и сборки полного гена из половин внутримолекулярной стыковкой половин гена в векторной ДНК; на фиг. Ь вЂ” второй вариант получения векторной плаз- миды и сборки полного гена интерфе" рона межмолекулярной сшивкой фрагментов при одновременной вставке их в векторную ДНК; на фиг. 7 — схема по- . лучения рекомбинантной плаэмиды для 10 экспрессии искусственного гена интерферона о 2 .человека с использованием плазмидного вектора psK 95.1 на фиг. 8 — то же, с использованием плазмидного вектора pBR-В1. 15 . Предлагаемый способ синтеза позволяет получить ген с любой напередзаданной структурой. Синтез гена интерферона о 2 человека и его свойства ранее в литературе не описаны. Ис-20 кусственный ген интерферона с . 2 человека, первичная структура которого представлена на фиг, 1, кодирует полипептид длиной 165 аминокнслотных остатков, соответствующий природному 25 интерферону оС 2 человека, однако является химическим соединением, принципиально отличающимся от природного гена по нуклеотидному составу и первичной структуре. Это отличие дости- 3О гается за счет введения в процессе синтеза кодирующих триплетов, обеспечивающих максимальную экспрессию гена в клетках E..соИ в результате более эффективной трансляции мРНК. Для синтеза гена его структуру разбивают на 7 фрагментов длиной до 100 пар оснований (фиг. 2). Для удобства клонирования синтетические фрагменты содержат на концах сайты, 4О узнавания рестриктаз, которые при необходимости удаляют из них на этапе сбсрки гена. Каждьп .из фрагментов, в свою очередь, разбивают на олигонуклеотиды длиной 9-15 звеньев (фиг. 2). Для обеспечения однозначного сшивания олигомеров ДНК-лигазой по стратегии Кораны разбивку фрагментов проводят с помощью ЭВМ по специально разработанной программе. Схему 5О синтеза олигонуклеотидов рассчитывают с учетом частот встречаемости различных повторов в составе последовательности нуклеотидов гена, а также с точ. .ки зрения минимизации затрат исходно-у го нуклеотидного материала, что значительно снижает трудоемкость синтеза. Способ получения гена, включающий молекулярное клонирование после лигазной сшивки в качестве стадии очист ки и характеризации, обеспечивает получение фрагментов гена в индивидуальном виде в необходимом количестве. Длину фрагментов выбирают оптимальной с точки зрения лигазной сшивки из олигонуклеотидов. Такой подход, впервые предложенньй и использованный и в данном изобретении является универсальным приемом для синтеза генома любой произвольной длины и последовательности. Химический синтез олигонуклеотидов проводят модифицированным фосфотриэфирным методом в растворе и на полимерном носителе, Оливонуклеотиды фосфорилируют с помощью полинуклеотидкиназы, 4-6 олигомеров сшивают действием ДНК-лигазы в дуплексные блоки, из которых затем собирают фрагменты для промежуточного клонирования Клонирование фрагментов после лигазной сшивки осуществляют в составе плазмид pBR 322, pBR 322 mph 3 и pUR 222, как показано на фиг. 3 и 4. Структуру рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты гена интерферона, подтверлщают методом Максама-Гилберта. Сборку гена проводят в два тапа. На первом этапе из фрагментов 1-4 и 5-7, соответственно, синтезируют две половины гена. На следующем этапе половины гена сшивают в полный ген, 1 который затем встраивают в вектор для экспрессии. Схема сборки N-концевой половины гена представлена на фиг. 3. Сборку проводят путем последовательной сшивки фрагментов по липким конщам в составе векторной молекулы. На последних стадиях с помощью ДНКполимеразы I u S --нуклеазы удаляют липкие концы сайтов Крп и Bam HI не входящих в состав гена и использующихся для удобства клонирования и. сшивки фрагментов. С-концевую половину гена собирают путем одновремен ной сшивки фрагментов 5-7 после кло-, нирования, как показано на фиг. 4, и последующей встройки в векторную плазмиду gUR 222, 1 Для осуществлейия сборки целого гена лейкоцитарного интерферона из половин необходимо сконструировать векторные плазмиды. 1092176 С этой целью сначала в плазмиде pBR 322 проклонируют íî EcoRI-сайту. синтетический линкерный додеканукле. отид AATTTAGATCTA, Полученную таким образом плазмиду рРК14, обеспечивающую устойчивость Е. cori к тетрациклину и ампициллину, отбирают по наличию сайта" рестриктазы Вя1 II и отсутствию cBATa EcoRI. Клонированием по BamHI-сайту додекануклеотида GATCCGAATTCG, содержащего EcoRI-сайт получают необходимую векторную плазмиду pPKlб. о 15 .Место соединения половин гена не является сайтом эндонуклеазы рестрикции, поэтому сшивку половин необходимо проводить по затупленным концам (удалением Hind III-выступающего конца М-концевой половины гена и заполне 20 нием EcoRI-выступающего конца С-пол@ вины гена). Такую сборку осуществляют двумя способами (фиг. 5 и 6). Согласно первому способу стыковку 25 половин проводят виутримолекулярно в составе плазмидного вектора (фиг. 5). С этой целью сначала в плазмиде рРК16 по сайтам Bgl II u Hind III реклонируют. N-концевую половину гена, выделенную ,из плазмиды pLeIF (7-250). В получен- З0 ную таким, образом плазмиду pLeIF (7-250). 2 вместо фрагмента EcoRI Sal I-287 встраивают С-концевую половину структурного гена. В результате полу . чают плазмиду pLeIRtl, в которой обе 35 половины гена находятся.в нужной для стыковки ориентации и разделены последовательно в 352 нуклеотидные пары. Для окончательной сборки гена ДНК плаэмиды pLeIFtl гидролизуют ре- 40 стриктазой Hind ХХХ, выступающие кон" цы удаляют мягкой обработкой S -нуклеазой, после чего ДНК подвергают гидролизу рестриктазой ЕсоКХ и достраивают липкие концы при помощй 45 ДНК-полимераэы I Е. соfj. (фрагмент Кленова) . Полученную таким образом ДНК обрабатывают Т4 ДНК-лигазой в условиях сшивки по тупым концам, после чего используют для трансфор- 50 мации клеток E. соЬ НВХОХ или ИМН 7110. Отбор трансформантов проводят гибридизацией колоний на нитроцеллюлозных фильтрах. В качестве зонда для гибридизации используют пентаде- 55 кануклеотид CTUGACAAATTCTAC, Строение полученной таким образом плазмиды подтверждают рестриктным анализом и анализом нуклеотидной последовательности вставки. Другой способ заключается в выделе. нии соответствующим образом подготовленных половин структурного гена и одновремеяяой вставке их в векторную ДНК.,В этом случае в качестве вектора используют большой BglI Sal I-фрагмент плазмиды рРК14, который выделяют электрофорезом в 57-ном полиакриламидном геле (ПАГ). Чтобы получить N-концевой фрагмент, ДНК плазмиды pLeIF (7-250), 2 сначала расщепляют рестрикта зой Н1пдХХХ, а после обработки S --нуклеазой гидролизуют 1 рестриктазой Bgill, и малый фрагмент выделяют электрофорезом в 57-ном ПАГ. Аналогичным образом для получения С-концевого фрагмента ДНК плазмиды pLeIF (251-501) гидролизуют рестриктазой EcoRI, липкие концы достраивают ДНК-полимеразой Х Е, соН после чего гидролизуют рестриктазой SafI, и фрагмент выделяют электрофорезом в 57-ном ПАГ. Зквимолярные количества половин сшивают ДНК-лигазой с векторным фрагментом,, и полученной ДНК трансформируют клетки Е, соЬ ВМН 7118. Отбор рекомбинантных плазмид проводят перекрестной гибридизацией с фрагментами N- и С-концевой половины структурного гена, а также с пентадекануклеотидом CTGGACAAATTCTAC. Для получения рекомбинантной ДНК, содержащей полный структурный ген лейкоцитарного интерферона с - 2 человека, гидролизованную рестриктазой В g2II плазмиду pLeIFt 17 сшивают с избытком нефосфорилированного 22-звенного олигонуклеотида GATCACACAGGATCCATGTGT, .содержащего сайт эндонуклеазы Bam HI и начало гена, и полученной ДНК трансформируют компетентные клетки Е.cori (фиг. 6). Для того, чтобы искусственный ген лейкоцитарного интерферона2,2 чело-века мог экспрессироваться в бактериальной клетке, необходимо снабдить его регуляторным сегментом ДНК, содержащим участки инициации транскрипции и трансляции. В качестве такой регуляторной ДНК выбирают промоторнооператорный фрагмен лактозного оперона Е.cori (содержит промотор lacUV 5, оператор и сайт связывания рибосомы), под контролем которого протекает эффективная экспрессия гена Д -галактозидазы в бактериальной клетке. 1092176 10.7 В качестве одного из вариантов векторной системы для экспрессии (фиг. 7) используют встрсйку гена в состав и вектора pSK95;1 (производное pBR322, содержащее 5 lacUV 5-промотор E. со.ь1.) путем сшивки ДНК-лигазой смеси вектора pSK95.1, обработанного рестриктазами EcoRI и Бай I гена интерферона, выделенного из состава плазмиды pLeIFt17 по сайтам ВдИ?-Saf I, и синтетического линкера, состоящего из олигонуклеотидов AATTCATGTGT u GATCACACATAG. В полученной в результате этого плазмиде pLeIF (Раас) fac- 15 промотор оказывается расположенным перед геном в положении, наиболее; благоприятном для экспрессии. В другом варианте (фиг. 8) в качестве вектора для экспрессии исполь- 20 зуют плазмиду рВК-BI отличающуюся от pBR 322 тем, что она содержит перед BamHI-сайтом 90-нуклеотидный промоторный фрагмент лактозного оперона. Клонирование в PBR""BI искусственного 25 гена интерферона (выделяют из плазмиды рЬеТРТЗ) по сайтам BamHI и ЗаХ I приводит к плазмиде pLeIF-BI, в которой экспрессию синтетического гена лейкоцитарного интерферона осуществляЗр т ют под контролем двух природных промоторов {Ptet и Pic). Экспрессия гена интерферона of.2 характеризуется в международных едини-. цах активности интерферона в лизатах,З -полученных после разрушения клеток Е.coli, несущих гибридные плазмиды pI.eIr {Pic) и PLeIF-B1. Способ получения полипептида с ак тивностью интерферона осуществляют 40 следующим образом. Химический состав олигонуклеотидов проводят, исходя из нуклеозид-3 -фос-. фатов, защищенных по гетероциклическим основаниям (кроме Т) и фосфорно- 4 му остатку.. Для защиты аминогрупп гетероЦиклов используют бензонльную группу для А и С и изобутиральную группу для G. Фосфатный остаток защИщается и-хлорфенильной ир -цианэтильной группами, 5 -ОН-группы— диметокситритильной или монометокситритильной группами. В качестве кон денсирующего реагента используют триизопропил- или мезитиленсульфотет55 разолид, в качестве полимерного носителя — полистирольный гель с 27. по-. перечных сшивок, Удаление 5 -концевых моно- и диметокситритильных групп при синтезе в растворе и на носителе ,проводят с помощью 10Х ТХУ или 2Х. бензолсульфокислоты, удаление 3 -Р-защитной цианэтильной группы — с помощью раствора триэтиламина в ацетонитриле или водном пиридине. Полное удаление защитных групп проводят обработкой бензальдоксиматом тетраметилгуанидия (или лития) и/или аммиаком и далее 80Х-ной уксусной кислотой. Промежуточные фосфортриэфиры. выделяют колоночной хроматографией на силикагеле в хлороформе.или в системе с обращенной фазой на силанизированном силикагеле в водном диоксане. Деблокированные олигонуклеотиды выделяют высокоэффективной колоночной хроматографией и метят с помощью Г 2 ЗЯ 1 Р 1 -АТФ и полинуклеотидкиназы для анализа и последующей сшивкн дНК-лигазой, для этогок смесй олигонуклеотицов, входящих в- состав син тезируемого фрагмента, за исключением 5 -концевых, добавляют )/10 объt ема 10 Х лигазного буфера {200 мИ трис-HCE,» ðÍ 7,5, 100 мМ Мя CX ) 100 мК меркаптеэтанап I-2 мкКм ф- ) АТФ и соответствующее количество полинуклеотидкиназы (из расчета 1 ед, фермента включает 1 нмоль P за 30 мин при 37 С). Реакционную смесь инкубируют 30 мин при 37 С I) затем добавляют 10-.кратный мольный избыток АТФ (по отношению к общему Ф количеству 5 -концов и инкубируют еще .30 мин. Реакцию останавливают добавлением 1/10 объема 100 мМ ЭДТА и смесь выдерживают 5 мин при 75 С. о После остывания добавляют 5 -концеI вые олигонуклеотиды и 1/10 объема О 100 мМ Мя CR, Буферный состав для сшивки восстанавливают с помощью раствора, содержащего 200 мМ трнсНСК, рН 7,5, 100 мМ Мя С(,1 и 100 мМ меркаптоэтанола, и добавляют лигазу I до концентрации 50-100 nM.. Сшивку проводят либо 4-18 ч при 10-. 15 С, либо 3 ч при комнатной температуре, добавляют 25 мкл ЗМ ацетата натрия, "доводят объем водой до 250 мкл, добавляют PHK до суммарной концентрации 50-100 мкг/мл и 750 мкл этанола, Раствор перемещивают и замораживают в жидком азоте.-После оттаивания месь центрифугируют. Осадок ресуспендируют в 250 мкл 0,3 М ацетата натрия, рН 7,0 и переосаждают, Оса;, 1092176 10 док промывают этанолом и высушивают в вакууме. Распределение продуктов сшивки ДНКлигазой проводят в 10-207.-ном полиакриламидном:геле,содержащем или не со-, 5 держащем мочевину (акриламид-бисакрил амид 19:1, электронный буфер 50 мМ .трис-борат, 1 мМ ЭДТА, рН 8,3) размером 20х40х0,06 см, либо 10х20>:0,06 см при градиенте напряжения 30-50 В/см 1О в течение 1,5-3 ч. Местоположение продукта на геле выявляют радиоавтографией с использованием пленки PM-1 и усиливающего о экрана в течение 1-2 ч, 15 Полосу, соответствующую продукту сшивки, вырезают из геля, элюируют электрофоретическим способом в течение 3-5 ч при F100-150 В и концентри-. руют на диализной пленке или ионообменной бумаге DE-81. Удаление продукта с бумаги производят промывкой 4х25 мкл 1 M NaCX и 7М мочевины и продукт обессоливают на колонке 0,3х х20 см с биогелем Р-4 в буфере 1 мМ трис-HCR, рН 8,0, 0,1 мМ ЭДТА. Средний выкод на стадии лигазной сшивки составляет 50-90Х. Клонирование синтетических фрагмен.тов после ДНК-лигазной шивки прово- 30 дят в плазмидах pBR 322, pUR 222 и, pBR 322 mpt 3. В типичном эксперименте к 0,2 мкг векторной молекулы добавляют 1-2 пмо1 ля 5 -фосфорилиронанного фрагмента и лигируют как описано. В случае получения плазмиды pLeIF (РЕас) в реакционную смесь добавляют по 20 пмолей нефосфорилироI ванных по 5.-концу линкерных олигону- 1п клеотидов 5 -ААТТСТАТСТСТ и 5— GATCACACATAG. Лигазной смесью трансформируют клетки E.cori обработанные ОаС1. и высеивают на 1,5X LB-агар, содержащйй 20 мкг/мл ампициллина (а также 10 М изопропилтиогалактозида и 40 мкг/мл Х-Gal нри клонировании в ,плазмиде pUR 222). Выделение пл ДНК для клонирования и гидролиз эндонуклеазами 50 рестрикции EcoRI ВашНЕ, Яа1 I HindIII, BgII Sau За, EcoRII, BspI, MspI, Pst I u KpnI проводят стандартным способом. В случае использования эндонуклеазы EcoRII плазмидную ДНК . 55 выделяют из штамма В 834. Рестрикционные фрагменты разделяют электрофорезом в 4-8Ж-. ном полиакриламидном геле, Фрагменты ДНК из геля выделяют методом электроэлюции и концентрируют, как описано. Выступающие 5 -концы удаляют с помощью экзонуклеазы, S . Для этого к 5 мкг ВажНЕ-гидролизата ДНК плазми. ды pLF N4 в 200 мкл буфера, содержащего 0,5 M NaCf, 30 мМ NaAc, рЦ 4,8, 3 мМ ZnSO добавляют 10 ед. S -нуклеазы и инкубируют 30 мин при 12 С. Затем фермент удаляют экстракцией нейтральным водным фенолом (рН 8,0) и ДНК осаждают спиртом. Выступающие 3 -концы ДНК удаляют 1 с помощью ДНК-полимеразы Е Е.сой. (фрагмент Кленова). Для этого 2 мкг плазмиды рЬРМЕ, гидролизованной эндонуклеазой КрпЕ, инкубируют 40 мин. о при 12 С в 100 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-НС(, рН 7,5, 10 мМ Mg СХ, 10 MM меркаптоэтанол, 0,05 мМ каждого d АТФ, Ы СТФ, d.СТФ и. СТТФ и 5 ед. ДНК-полимеразы, Белок удаляют экстракцией фенолом и ДНК высаживают спиртом. Эти же условия используют для превращения липких концов в тупые на стадии сборки полного гена из половин. Отбор трансформантов, содержащих необходимый фрагмент, проводят с помощью метода гибридизации in situ на нитроцеллюлозных фильтрах, используя в качестве зондов P-меченные синте.И тические олигонуклеотиды или более длинные фрагменты после сшивки ДНКлигазой. Колонии переносят на фильтр, проводят обработку фильтра для разрушения клеток 0,5 М NaOH в течение 5 мин, фильтрат нейтрализуют в растворе 0,2 М трис-НС1 ., рН 7,0, 1 М NaCX промывают в 0,25 М фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 0,3 И NaCE цитрат натрия, сушат при 80 С в вакууме,. а затем выдерживают в течение 2-16 ч в гибридизационной смеси состава: 0,04Х фиколл 400; 0,04Х бычий сывороточный альбумин; 0,047 поливинилпирролидон; 0,9 М ИаС1, 0,09 М:цитрат. натрия; 0,2Х додецилсульфат натрия, Р-меченный зонд с радиоактивностью 10 имп/мин/мкл. Температуры гибридизации составляют: для олигонуклеотидов длиной 30 и более нуклеотидных остатков 55-65 С, а для олигонуклеотидов длиной 21-23 ос0 ° татка — 45-50 С; для олигонуклеотида о длинои 15 остатков - 37 С. Положение колоний, содержащих искомую последо1092176 Предла r аемый pBR 322 (контроль) BMH 2,4 10 7118 1,4 10 5 10 -10 310"610 7118 BMH То же pLeIP-BI Ptet Plac 21!8 вательность ДНК, определяют радиоав" тографией, используя пленку PT-1. Первичную последовательность фраг ментов в составе гибридных молекул определяют методом Максама-Гилберта. 5 Для мечения 5 -концов используют полинуклеотидкиназу, как .описано, а i для мечения 3 -концов проводят достройку с помощью ДНК-полимеразы. Тестирование активности интерферо- 10 на в клетках Е.cori проводят известным способом. 1 мл культуры Е.coli (штамм 294 или gMH 7118), трансформированной гибридной плазмидой с искусственным геном, выращивают. н» LB-сре- 15 де с 50 мкг/мл ампициллина до А 1 и разбавляют 25 мл среды M 9, содержащей 0,2Х глюкозы, 0,57. казаминовых кислот, 50 мкг/мл ампициллина и 1 MM изопропилтиогалактозид. Когда клетки достигают плотности А 5 = 0,5 их осаждают центрифугированием, суспендируют в 1 мл 15Х сахарозы, 50 мл трис-НСС, рН 8,0, 50 мМ ЭДТА. К суспензии клеток прибавляют 1 мг лизоци- 25 ма и через 5 мин при ОС разрушают: клетки ультразвуком. Центрифугируют l0 мин при 100 000 g, Активность ин-. терферона определяют в супернатанте, сравнивая с активностью стандартного ЗО лейкоцитарного интерферона (препарат ВНИИОЧБ, Ленинград, охарактеризованный относительно международного стандарта (В69/19) методом ингибирования цитопатического эффекта). 35 Полученные и литературные данные для сравнения приведены в таблице. Ф BMH Искусственный pLeIF Plac Plac Как видно из таблиць|, использование искусственного гена по сравнению с природным обеспечивает значительное повышение экспрессии (числа моле" кул продукта на клетку L .cori), cpa8zumoe с эффектом удвоения промотора, Этот вывод является справедливым и для системы экспрессии с триптофановым промотором, использэванном в прототипе. Очевидно, что экспрессия искусственного гена д.2 под контролем триптофанового промотора, использованного в прототипе, превышает уровень 9000 молекул на клетку. Внедрение B СССР микробиологического способа синтеза интерферона с использованием искусственного геиа позволяет значительно. увеличить производство препарата для клинических и научных целей. Интерферон, получаемый микробиологическим путем, не отличается по свойствам от природного соединения и может быть получен в высокоочищенном состоянии. Значительный практический интерес представляет использование искусственного гена интерферона g(.2 в других, системах экспрессии в Е.coli а также создание продуцентов на основе промышленных микроорганизмов. Синтетический искусственный ген интерферона А2 не имеет природных аналогов. Он может быть использован в дальнейшем для создания продуцентов новых неприродных интерферонов с измененной первичной структурой, обладающих другими свойствами. 1,4 10 5 10 -10 3100-6100 1092176,13 Продолжение таблицы plGII7R Plac 3,5 10 2 10 Н8!01 pFIF lac9 Тандеиный 3,5 IQ 9 10 Plac 2250 Прототип 3,5 10 3,6 10 9000 294 Природный 2 pLeIF A25 Ptrp Expression of the human fibroblast interfегоn in Е.coli. Т. Taniguchi et al. Proc. Nat. Acad Sci. USA, 1980, 77, и 9, 5230-5233. Synthesis of human fibroblast interfегоn by Е.coli. Q. Goeddel et al. Nucl. Acids Res. 1980, ч. 8, .и. 18, 4057-4074 3092)76 Qб 6, 3 3 b L -5 8 Я b б О Ф c4м Q v и он л< н ф м ool u 1 Ф Л Ь б о е Цф 53 Я" 1 ОЬ б cl сч у. ul и L og н ,, бЬ 1 Я QД g3 М ь о Р hà бб У5 м 5 b э .а сч ц1 "Р и - „3 ф s v v б Ь 1 б Ь 1 а 0 О И и б Т5 4 о о bi б о b-сло е н 1 э o v . а63 Л е и <л 3 ь Т E.Ф 3 Я i 3 1 Во М" %э о g 3 2 v o Ое ОН Я м t» а м Я О Р 7 Ф 3 5 э. б b 5 3 gl 5 Уb g g.-3 3 л 33 5 vl ю Ь б Л v v h,ечС и о о b б 35 ь сч о v ° с и Л 1»ng о н 1 о3 ul v. b б 4 Ь б Уь gg v 4 сан м gl g сп н 1092176 фй! 3.5 м I Ю l4 1 ° Ч <Ю 1 э Й ф фа Д и Ц Ч 8 g З (ъ «, Ф ° ф8 ч н! r б t е g3 ь =" т 1 м э ч (М н 4 ю 3 6 о оч(ц ВРЫм 5 3 5 3 оц У1 Ь 3ь Р Ф и Фц $ Т Ю E .g!j! ч gg g 7 о ч и 4 с 1 М о о! 4 Ю! ) Ь 1 8! 4 ч! К 3 7 ь! 3. p) б Л. -$ 4 v! ч б В Л Ь 3 1 ьоч ч ч л b н е4 (ю! " 3 1 оц ч! v Л и Я Р 3 Л 8! Ж Я 4 -Ц,.. ю с Ы «! и и yg v ь у б CL е а ° в н Й о н о Ж Е- Б ю а и сАОои -(с5 < о и о Щ о О 1 и о Ф и сч о Q 1 cv u — o о I и О 1 О .и о и Е» v .u o u.О 1-» Ф Ю о - o v СЧ (-» 1-(v 1- н о И < а е» Ю о с ) О (-» и О -< и и О о no С3 -4 С? сч и о < и и 1- 1- а СО о c) u os сч и С3 о »» о C О а о -» а.- е с »и и < н о н 8 б w н 00 - а 4 е« .и о 1 о о Е- o u u o о. о Rf н o u р (-(ои о - — o u ао о С Ъ v o н и 1092176 н и й. О & 4 О И о н» « ю-1 сь v с/) 1- 1 1 u v н v.u о v и 1О 1 и о о ю сп «4 н н u o н» е-» и о д о v ° » « Е» Ж ОС е» v u О и < Н ov а (-4 Е (ч и 34 и (-4 о н о О@3 оо съ и v О и 00 (4 е В ч ф(og н ж Щ в DQ н н DC о t2 1 Ю о 1092176 ov o I I л о о о v u И 4 Ð4 о Аи рч Ь О о о 1 и Ь б он ° у ° 4 М hq Q и .Ъ Ф ь., Ф ; 4 ф е ! ( t 3 8 Ц з "> CS ч М 1 1092176 ь В Ф . М 1092176 Ф3 1092176 ) 092)76 1092176 109217б ЩЩЩИ 38Rgs 3207/16,у- sz 522 11O aacaoe Ф Ф фа аЪ Ф, Д С (Ьд <4g Ъ <4 9 Ъс с ф
