Способ конструирования рекомбинатной плазмидной днк и штамм продуцент эндонуклеазы рестрикции

 

1. Способ конструирования рекомбинантной гшазмидной ДНК pIL RV8, заключающийся в том, что среди клонов Escherichia coli ВКМ В-1450 Д с плазмидной ДНК PILRV7 отбирают клоны, содержащие укороченную на 500-600 пар оснований плазмидную ДНК pILRV7 Л , обладающую генами рестрикции и модификации Есо -RV и имеющую уникальный сайт эндонуклеазы рестрикции , затем вьщеленную плазмидную ДНК PILRV7 а к ДНК Фага с 1 875 обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Bg II, образукициеся фрагменты сшивают ДНК-лигазой фага Т4, полученной смесью рекомбинантных молекул ДНК трансформируют клетки Escherichia coll JC 5183 и из клонов, устойчивых к ампициллину и обладающих иммунитев том к фагу X вьделяют целевую рекомбинантную плазмидную ДНК. . 2. Штамм Escherichia coli ВКМ В -1455 Д (Всесоюзная коллекция Микроорганизмов при ИБФМ АН СССР) 8 е продуцент эндонуклеазы рестрикили ECORV. 4; СО ;о

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ 1074139 A р д С 12 N 15/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

М ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3446651/28-13 (22) 01.06.82 (46) 30.12.84. Бюл. У 48 (72) А.А. Баев, А.Н. Кравец, А.С. Солонин, Н.П. Кузьмин, А.Ф. Мороз, Л.И. Глатман и В.И. Таняшин (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф, Гамалеи (53) 661-093/098 (088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР по заявке N - 3330201/30-15 (120492), кл. С 12 N 15/00, 30.07.81 (54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК И ШТАММ

ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, (57) 1. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pIL RVS, заключающийся в том, что среди клонов

Escherichia coIi ВКМ В-1450 Д с плазмидной ДНК pILRV7 отбирают клоны, содержащие укороченную на 500-60 1 пар оснований плазмидную 5НК pILRV7 d обладающую генами рестрикции и модификации Есо RV и имеющую уникальный сайт эндонуклеазы рестрикции BgtII, затем выделенную плазмидную ДНК

pILRV7 д и ДНК фага 3 с 1 875 обрабатывают зндонуклеазой рестрикции

Bg 0 II, образующиеся фрагменты сшивают ДНК-лигазой фага Т4, полученной смесью рекомбинантных молекул

ДНК трансформируют клетки Escherichia

coIi J С 5183.и из клонов, устойчивых . к ампициллину и обладающих иммуните- I том к фагу А вь1целяют целевую рекомбинантную плазмидную ДНК.

2. Штамм Escherichia caIi ВКМ

В-1455 Д (Всесоюзная коллекция, Микроорганизмов при ИБФМ АН СССР) продуцент эндонуклеазы рестрикции I| .0RV.

Эиюб

Ю

4h

leak

CO

C©

1 1074

Изобретение относится к микробио-логической промышленности и генетической инженерии.

Фермент R. EcoRV используют í генетической инженерии, как в экспериментах по конструированию рекомбинантных ДНК, так и при изучении первичной структуры ДНК.

Известен способ конструирования рекомбинатной плазмидной ДНК, который основан на обработке двух плазмид эндонуклеазами рестрикции, лигировании с помощью ДНК-лигазы фага Т, трансформации клеток

E. coII. смесью образующихся фрагмен15 тов плазмид, отборе среди трансформантов, устойчивых к ампициллину клонов, обеспечивающих рестрикцию и модификацию фага с последующим выделением соответствующей плазмидной ДНК (1).

Известна плазмидная ДНК, коди. рующая синтез эндонуклеазы рестрикции R. EcoRV, известен соответствующий штамм Е. coIi — продуцент R. EcoRV и способ получения указанного фермента.

Недостатком известной рекомбинатной ДНК является относительно низкий уровень синтеза фермента, 30 относительная нестабильность рекомбинантной ДНК pILRV7 и в клетках бактерий, что ограничивает возможность ее использования в промышленных условиях.

Целью изобретения является спо- З5 соб конструирования рекомбинатной плазмидной ДНК pILRV8, а также получение штамма-продуцента FcoRV и увеличение выхода целевого продукта-фермента эндонуклеазы рестрик- 40 ции EcoRV.

Для достижения цели в способе конструирования рекомбинатной плазмидной ДНК pILRV8,заключающемся в том, что среди клонов Escherichia 45

cosi ВКМ В-145ОД с плазмицной ДНК

pILRV7 отбирают клоны, содержащие укороченную на 500-600 пар оснований плазмидную ДНК pILRV75, обладающую генами рестрикции и модификации EcoRV и имеющую уникальный сайт эндонуклеазы рестрикции 8g t II, .затем выделенную плазмидную ДНК

pILRV7.> и ДНК фага Д с 1 875 обрабатывают эндонуклеазой рестрикции 55 . Bg F II образующиеся фрагменты сши- вают ДНК-лигаэой фага Т4, полученной смесью рекомбинантных молекул ДНК

139 (2 трансформируют клетки Escherichia

coIi 1С 5183 и из клонов, устойчивых к ампициллину и обладающих иммунитетом к фагу выделяют целевую рекомбинатную плазмидную ДНК.

Для получения штамма-продуцента используют штамм Escherichia coIi

BKM В-1455Д (Всесоюзная Коллекция

Микроорганизмов при .Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР) — продуцент эндонуклеазы рестрикции EcoRV.

Пример 1. Конструирование рекомбинатной плазмидной ДНК pILRV8 состоит из двух этапов.

На первом этапе проводят поиск стабильных вариантов плазмидной рекомбинантной ДНК pILV7. Для этого штамм Escherichia coIi ВКМ В-1450Д, содержащий плазмиду pILRV7, подращивают в I„B бульоне в течение 15 ч, после чего высевают на селективную агаризованную среду с ампициллином ( — бульон содержит 10 г бактотриптона, 5 r дрожжевого экстракта и 10 r NaCI рН 7,4 на 1 л воды).

Среди выросших клонов отбирают клон клеток, содержащий стабильную плазми, ду,названную рЕЕКЧ7 и сохранивший фе- ° нотипические признаки -штамма Е, col i

ВКМ В-1450Д. Из клеток этого клона выделяют плазмидную ДНК по методу (CIeweII and HeIinsky) 1969, PNAS

62, 1159-1166).

Рестрикционный анализ выделенной плазмиды рП.RV7 проводят: с помощью эндонуклеаз Ро1; $,0ô ll,scowl

На втором этапе в полученную плазмиду PI L,ЫЧ7Л вводят область иммуни-, тета фага 1 с промотором ранних генов Pr и термочувствительным репрессором. Для этого выделяют ДНК фага с 1857 по методу (А.D. Kaiser, Hognes D.S. 1960, J. Nol BioI

392-415). мкг ДНК плазмиды pILRV7 и

4 мкг ДНК Aara 3 с 1 857 инкубируют в буфере А (20 мМ Трис-НС0 рН 7,6, 10 мМ М С,10 мМ дитиотреитола) с эндонуклеазной рестрикции ВяF ЕЕ.

Гидролиз проводят в течение часа при 37 С, после чего гидролизат проверяют электрофорезом в 0,9Ж агарозе в ацетатном буфере. Фрагменты

ДНК фага ll с 1857 (2 мкг) смешивают с линейной ДНК плазмиды

pI LRV7 и (О, 2 мкг), добавляют дитиотреитол и АТФ до конечной концентрации 10 мМ и 100 мкМ соответственно, 3 10741 и 5 ед. лигазы фага Т4. Общий объем лигируемой смеси — 30 мкл. Лигирование проводят в течение 1 ч при

12 С, после чего добавляют 210 мкл

Н О, дитиотреитол и АТФ до конечной концентрации 10 мМ и 100 мкМ соответственно, а также 10 ед. лигазы.

Общий объем лигируемой реакционной смеси доводят до 300 мкл. Лигирование продолжают при 12 С 48 ч. Через шестнадцатичасовые интервалы отбирают аликвоту (100 мкл) и трансформируют Са -клети Е. coIi J С 5183.

Получение компетентных клеток и трансформацию проводят по методу (Cohen А.N.а.с. Y Chang 1972, PNAS USA 69: 2110-2114).

Трансформанты высевают на селективную среду с ампициллином (30 мкг/мп), предварительно проинкубировав 10 мин с фагом с 126 из расчета 108 фаговых частиц на чашку.

Выросшие трансформанты проверяют на наличие иммунитета к фагу 1 с

1 857. Для этого сравнивают эффективность посевов фага Д с 1 857 и фага Л1 (imm) 21 на клетках Е. coli 3С 5183, а также на клетках этого же штамма, не, содержащих рекомбинантных ДНК.

I

Из отобранных трансформанты выделяют рекомбинантную плазмидную ДНК РЭЬРV8 методом (KIein D.L.

SchIesing Е, MeIIo R.D. 1980

PIasmid 3,88-93). Полученную ДНК з5 анализируют с помощью рестриктаз

Bg 9 II, Pst I, Hind III.

На основе данных рестрикционного анализа построена схема рекомбинатной плазмидной ДНК РЗ .РЧ8. 40

Полученная рекомбинантная плазмидная ДНК PI(ЯЧ8 содержит гены системы рестрикции-модификации

EcoRV ген бета-лактамазы, определяющий резистентность клеток к ампи- 45 циллину, область иммунитета фага Д с термочувствительным репрессором

cI, ген rex, а также промотор ранних генов Pr. Рекомбинантная— плазмидная ДНК pQL Рч8 состоит из 50 плазмидной ДНК p3L Рч Тй; расщепленной по Bg6 II-сайту (размер ДНК плазмиды 5.8 т.п.о.) и Bg(II-фрагмента ДНК фага 3 CI 85? с размером

2.4 т .п.о. Общий размер рекомби- 55 нантной плазмидной ДНК р1 йч8 равен 8.2 т.п .о. В ДНК плазмиды имеются два сайта эндонуклеазы Bg (II

39 4 по три сайта эндонуклеаз Н1пй Ш и

Pst

Пример 2. Для получения штамма-продуцента эндонуклеазы ре- стрикции EcoRV рекомбинантную плазмидную ДНК pILRV8 трансформируют в штамм E. coIi С 5183.

Клетки штамма Е. coIi JC 5183 подращивают до титра 2-3 10 кл/мл, В после чего осаждают при 6000 я

15 мин при температуре 0 С. Клетки суспендируют в равном объеме 0, 1 М раствора хлористого кальция и выдерживают при О С 1 ч, после чего повторно осаждают при 6000 g, ООС и ресуспендируют в 0,1 М раствора хлористого кальция.

К 50 мкл ДНК, полученной после обработки ДНК лигазой фага Т, добавляют 100 мкл компетентнйх клеток. Смесь выдерживают 20 мин при

0 С, затем 2 мин при 42 С и 10 мин при комнатной температуре, добавляют 1,3 мл среды LB инкубируют

2 ч при 37 С с аэрацией. Суспензию высевают на чашки с твердой средой, содержащей ампициллин (30 мкг/мл).

Трансформанты отбирают по методу, описанному в примере 1.

Сконструированный штамм Е.coIi

BKM В-1455 Д и штамм Е. coIi

ВКМ В-1450 Д проверяют на продукцию рестриктазы Есор. Для этого обе культуры подращивают в 1 л среды ЬВ до титра 5 108 клеток

1 мл при. 30 С и 37 С. Клетки осаж/ дают центрифугированием при 6000 g

15 мин., после чего по 0,9 r (сырой вес) биомассы каждого штамма суспендируют в 6 мл буфера 50 мМ трис-НСЕ, рН 7,6, 0,2 M NaCI, 3 мМ-меркаптоэтанола, 100 мкг/мп лизоцима и выдерживают 40 мин при

0 С. Клетки разрушают ультразвуком.

Полученный экстракт центрифугируют при 48000 @, 2 С. Супернатант используют для определения активности фермента. С этой целью делают серийные разведения эКстракта:

1/100, 1/500, 1/1000, 1/5000, 1/25.000, 1/50000.

По 1 мкл каждого разведения инкубируют 1 ч при 37 С с 1 мкг ДНК фага и в 30,мкл инкубационной смеси с 50 мМ трис-HCR рН 7,6, 50,мМ АСС, 10 мМ Mg СР,, 6 мМ р-мер. каптоэтанолом.

Уровень активности фермента эндонуклеазы рестрикции Е. coIi RV

1074139

Редактор Л. Письман Техред С,Мигунова Корректор M. Демчик

Заказ 9246/4

Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул . Проектная,4 в бесклеточном экстракте сконструированного Е.coIi ВКМ В-1455 Д при вьг ращивании при 37 С более чем в 5 раз выие уровня активности этого же фермента в штамме ВКМ В-1450 Д и состанлнет в пересчете на 1 г биомассы (сыр и вес) более чем 15.000.000 ед. акти..ности фермента EcoRV. При

30 C уровни активности фермента в

5 обоих штаммах одинаковы.