Штамм @ @ -82 продуцент @ -амилазы и питательная среда для культивирования штамма @ @ -82 (варианты)

 

1. ШТАММ Baciilus subtilis-82 (коллекция музея промьппленных микроорганизмов , коллекционный номер ЦМПМ В-2595) - продуцент ot-амилазы, .используемый для осахаривания крах-малсожержащего сырья в производстве спирта. 2. Питательная среда для культивирования штамма Bacillus subtilis6-12 Кукурузная мука 0,9-1,0 Диаммонийфосфат 0,2-0,5 Мел 0,15-0,20 Мочевина 4,0-4,5 Кукурузный экстракт 8 (О До 100 Вода 3. Питательная среда для культивирования Bacilfus subtilis-82 продуцента сб-амилазы, содержащая в качестве источников углерода и изота кукурузную муку и диаммонййфосфат , а также мел, отличающаяся тем, что, с целью увеличения амилолитической активности продуцента, среда дополнйтел,ьнр . . содержит мочевину и барду при следующем соотношении компонентов, мас.%: 6-12 Кукурузная мука 0,9-1,0 Диаммонийфосфат 0,15-0,20 Мел 0,15-0,20 Мочевина До 100 Барда

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 3523270/28-13 (22) 15. 12. 82 (46) 07.04.84. Бюл. 11« 13 (72) Э.И.Бурцева, Е.А.Двадцатова, Б.А.Устинников, Н.Я.Васильева, Т,М.Рыкова, С.И.Карайчев, М.В.Сидорова и Н.Н.Воронцова (71) .Всесоюзный научно-.исследовательский институт продуктов брожения (53) 663.15(088.8) (56) 1. Бахматова. И.В., Глемжа А.А., Жарикова Г,Г. О связи между морфологической изменчивостью ВасШиз

subtilis и биосинтезом гидролитичес-, ких ферментов. "Прикладная биохимйя и микробиология", 1981, ХУП, вып. 3, с. 415 °

2. Авторское свидетельство СССР

У 840099, кл. С 12 С 7/04, 1981. (54) ШТАММ BACILLUS SUBTILIS — 82 ПРОДУЦЕНТ OL-АМИЛАЗЫ И.ПИТАТЕЛЬНАЯ

СРЕДА ДЛЯ.КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА

BACILLUS SUBTILIS — 82 (ВАРИАНТЫ) ° (57) 1. ШТАММ Васййз subtilis-82 (коллекция музея промьипленных микроорганизмов., коллекционный номер

ЦМПМ В-2595) — продуцент ф(.-амилазы, используемый для осахаривания крах- малсожержащего сырья в производстве спирта.

2. Питательная среда для культивирования штамма Васд11из subtilisЗ(51) С 12 N1/20,, С 12 N 9/28, С 12 N 15/00

82 — продуцентаю(,-амилазы, содержащая в качестве источников углерода и азота кукуруз*ую муку, диаммонийфосфат и кукурузный экстракт, а также мел и воду, о т л и ч.а ющ а я с я тем, что, с целью увеличения амилолитической активности продуцента, среда дополнительно содержит мочевину при следующем . соотношении компонентов, мас.Ж:

Кукурузная мука 6-12 Диаммонийфосфат 0,9-1,0

Мел О, 2-0,5

Мочевина 0,15-0,20

Кукурузный экстракт 4,0-4,5

Вода До 100

3. Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis-82 продуцента ц(,-амилазы, содержащая в качестве источников углерода и изота кукурузную муку и диаммонийфосфат, а также мел, о т л и ч а ющ а я с я тем, что, с целью увеличения амилолитической активности продуцента, среда дополнительнр содержит мочевину и барду при следующем соотношении компонентов, мас.Ж:

Кукурузная мука 6-12

Диаммонийфосфат 0,9-1,0

Мел 0 15-0,20

Мочевина 0,15-0,20

Барда До 100

1084297

Изобретение относится к спиртовой, крахмало-паточной и микробиологической промышленности, в частности к получению штаммов микроорганизмов, обладающих высокой амилолитической активностью, и питательным средам для их культивирования.

Известны штаммы Вас1Ииа subtiiisпродуценты амилолитических ферментов, обладающие высокой амилолитической lO активностью (1) .

Недостатком этих штаммов является длительность процесса культивирования, что затрудняет их получение в производственных условиях и использо" 15 иание для осахаривания.

Наиболее близким к предлагаемому является штамм Вас Ипа mesentericus

ПБ sp. ВНИИПрБ, продуцирующий М-амилазу. Он имеет следующие морфологи- 20 ческие признаки: палочки размером

4-5 мк 0,8-1,0 мк, иногда образующие цепочки из 2-4 палочек. Однообразно окрашенные, без капсул, неподвижные, окраска по Граму поло- 25 жительная, окрашиваются разбавленным раствором.метиленовой сини или нейтральротом. Протоплазма окрашивается" однородно. Бактерия спорообразующая; на мясопептонном агаре дает колонии g0 белые, или тускло-белые округлой формы диаметром 2-2,5 мм. Продолжительность культивирования штамма

72 ч (2).

Недостатком этого штамма является 35 то, что он не обладает достаточной амилолитической активностью. Максимальная активность штамма составляет 30-40 ед/мл культуральной жидкости.

Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является питательная среда для культивирования BaciPEus

mesentericus ПБ sp. ВНИИПРБ- про- 45 дуцента К-амилазы, содержащая в ,качестве источников углерода и азота кукурузную муку, диаммонийфосфат и кукурузный .экстракт, а также мел и воду при следующих соотношениях компонентов, вес.7:

Кукурузная мука 6,0

Диаммонийфосфат 0,9

Кукурузный экстракт 1,0

Мел 0,2

Вода Остальное

Однако у данной питательной среды недостаточно высокая активность выра щенного на ней полученного штамма

Вас. зиЪй1Из-82 — 50 ед/мл к.ж.

Цель изобретения — получение ново. го штамма бактерии, обладающего высокой амилолитической активностью, который можно использовать для разжижения и осахаривания крахмалсодержащего сырья в спиртовой промышленности, увеличение амилолитической активности продуцента.

Штамм Bacillus subtilis 82 получают методом адаптации с последующей селекцией к питательной среде известных штаммов вида Bacillus subtifis в частности, Bacillus subtiXis хранящегося в музее чистых культур

ВНИИПрБ под,У 357 и обладающего

К-амилазной активностью в 20 ед/мл к.ж. Исходный штамм Bacillus subtilis 357 рассеивают на плотной питательной среде, содержащей крахмал.

Отбирают колонии, образующие зоны гидролиза крахмала, а при глубинном выращиваний - обладающие в сравнении с исходным штаммом повышенной активностью с6-амилазы. В результате длительной адаптации к среде, содержащей источники азота и углерода (крахмал, дрожжевой автолизат), отбирают варианты, обладающие д -амилазной активностью в 50 ед/мл к.ж.

Получают штамм. Bacillus subtiФала 82 - продуцент с -амилазы, имеющий следующую характеристику.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидные, средние размеры 0,6-0,84 ммкх 2,4-3,5 ммк, подвижные, грамположительные, находятся отдельно или в виде .небольших цепочек в 2-4 клетки.

Культуральные признаки: на агаризованной среде, состоящей из 507 мясопептонного бульона и 50К ячменного сусла, 24 -часовая культура образует колонии диаметром 3-4 мм, 48-часовая - диаметром 5-7 мм.

При выращивании на жидкой среде указанного состава при 40 С на

24 ч образуется пленка с глубокими крунными складками, белая, с едва заметным зернистым налетом, бульон прозрачный.

Физиологические признаки:аэроб, культура гидролизует крахмал, декст. рины, ассимилирует аммонийные соли органических кислот, хорошо растет на пентоне, казеине. Температурный

1084297

3 оптимум роста 35-40 С. Оптимум рН роста 5,0-8,0. Культура хранится в пробирках на мясопептонном агаре.

Для определения активности стерильную питательную среду засевают штаммом Bacillus subtigis-82, после чего инкубируют культуру при 40 С на качалке при 220 об/мин.. После

72 ч роста в культуральной жидкости определяют активность оС-амилазы. 10

С целью. увеличения амилолитической активности .продуцента питательная среда для культивирования штамма Bacillus subtiEis-82-продуцента

®-амилазы, содержащая в качестве 15 источников углерода и азота кукурузную муку, диаммонийфосфат и кукурузный экстракт, а также мел и воду, дополнительно содержит мочевину нри следующем соотношении ком- 20 понентов, мас.X:

Кукурузная мука 6-0-12,0

Диаммонийфосфат (МНq)2НР04 0,9-1,0

Мел 0,2-0,5 25

Кукурузный экстракт 4,0-4,5

Мочевина О, 15-0,20

Вода До 100

По второму варианту питательная среда для культивирования ВасхИиз Зр

f subtilis-82 — продуцента g-амилазы, :, содержащая в качестве источников углерода и азота кукурузную муку и диаммонийфосфат, дополнительно содержит мочевину и барду при следую35 щем соотношении компонентов, мас.X:

Кукурузная мука 6,0-12,0

Диаммонийфосфат (НН,1)2 ИРОЙ 0,9-1,0

Мел О, 15-0, 20 40

Мочевина О, 15-0, 20

Барда До 100

Использование барды позволяет снизить пеиение среды в процессе выращивания продуцента, что способ- 45 ствует сохранению стерильности культуры. Кроме того, замена кукурузного экстракта бардой способствует снижению себестоимости продукта.

Пример 1. Повевной материал 50 штамма Bacillus subtifis-82 У ЦМПМ

В-2595, используемый для засева ферментационной среды, представляет собой бактериальную пленку, выращенную в течение 48 ч при 40 С на 55 жидкой среде, состоящей иэ равных объемов мясопептонного бульона и .ячменного сусла концентрацией 7 Б.

Культуру выращивают глубинным способом с засевом среды кусочком бактериальной пленки в течение 48 ч о при 35 С на качалке с числом оборотов

220 об/мин на ферментационной среде следующего состава, мас.X:

Кукурузная мука 6,0

Диаммонийфосфат 0,9

Мел 0,20

Мочевина 0,15

Барда Остальное

Контролем служит ферментационная среда для выращивания Bacillus mesentericus ПБ sp. ВНИИПрБ следующего состава, мас.%:

Кукурузная мука 6,0

Диаммонийфосфат 0,9

Мел 0,20

Кукурузный экстракт 1,0

Вода Остальное

Полученные при этом активности -амилазы представлены в табл. 1.

Пример 2. Посевной материал Bacillus subti1is-82 выращивают аналогично примеру 1.

Выращивание Bacillus subtilis-82 проводят глубинным способом на качалке с числом оборотов 220 об/мин при 35 С. в течение 48 ч на фермено тационной среде следующего состава, мас,%:

Кукурузная мука . 6,0

Диаммонийфосфат 0,9

Мел - 0,2

Кукурузный экстракт 4,0

Мочевина О;15

Вода Остальное

Полученные активности представлены в табл. 2. Контролем служит питательная среда по примеру 1.

Пример 3 ° Посевной материал .выращивают аналогично примеру 1.

Выращивание штамма BaeiDus- subtilis82 проводят глубинным методом на качалке с числом оборотов 220 об/мин о при 35 С в течение 72 ч на ферментационной среде следующего состава, мас.X:

Кукурузная мука .12,0

Диаммонийфосфат 0,9

Мел 0,5

Кукурузный экстракт 4,0

Мочевина 0,15

Вода Остальное

Полученные активности представлены в табл. 3. Контролем служит питательная среда, приведенная в примере

1084297

Активность C -амилазы предлагаемого штамма BaciItus зиЬ 121з-82 на разных вариантах питательных сред для культивирования достигает 100120 ед/мл, т.е. втрое превышает активность известного штамма. Выход спирта ° при сбраживании различных источников крахмалистого сырья составляет

15 58,8-65,6 мл, что на 0,8-3,2 мл превышает выход спирта при использовании известного штамма.

Таблица 1 ц -амилазная активность бацилл на известной и новой средах

Of,-амилазная активность, ед/мл к.ж.

Среда

Штамм

BaciIfus mesentericus ПБ sp. ВНИИПрБ

Bacillus subtifis-82

25,0

Известная

Новая

60,0

Bacillus subtifis-82

50 0

Известная

Таблица 2 ф -амилазная .активность ед/мл к.ж.

Штамм

Bacif fus mesentericus ПБ sp. ВНИИПрБ

Bacillus subtilis-82 40,0

70,0

Таблица 3

g, -амилазная активность, ед/мл к.ж.

Штамм

Вас Рпцз шезепСегдсиз ПБ sp. ВНИИПрБ

Baciffus subtilis-82

45,0

120,0

ЗНИИПИ Заказ 1926/19 Тираж 522 Подаисиое

Ф

Филиал ППП "Патеит", т.Рагород, уа.Ироектиаа, 4

Пример 4. Посевной материал выращивают по методу,. изложенному в примере 1. Выращивание штамма Baciffus subti2is-82 проводят глубинным методом на качалке с числом оборотов

220 об/мин при 35 С в течение 60 ч на ферментационной.среде следующего состава, мас.Ж:

Кукурузная мука 9,0

Диаммонийфосфат 1,0

Мел 0 5

Мочевина 0,2

Барда Остальное

BaciXZus subti2is-82 — активность

1(ф ед/мин.

Bacillus mesentericus ПБ sp. активность 40 ед/мл.

Таким образом, реализация изобретения позволяет повысить активность Ж-амилазы за счет использования нового штамма — продуцента и

5 новой питательной среды.