Способ получения диагностического иммуноглобулина к вирусу западного нила

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА К ВИРУСУ ЭАПАдаОГО НИЛА, включающий приготовление видоспецифического антигена вируса Западного Нила, гипериммунизацию мышей этим антигене, получение иммунной асцитной жидкости и выделение нэ нее иммуноглобулина, о т л ичающийся тем, что, с целью повьиаения видовой специфичности им муноглобулина , иммунизацию мышей проводят видоспецифическим антигеном, остаточный вирус в котором инактивируют прогреванием в течение 20 24 ч пои 36-37°С.

СОЮЗ COBETCHHX

СОЦИАЛИСЧЧ4ЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) (Я) A 61 К 39 00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЙЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

В"" (".-"; ю щ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ и

Н АВТОРСКОМ,Ф СВИдЕТЕЛЬС ГВУ (21) 3433563/28-13 (22) 05.05,82, (46) 15.07.84. Бюл. Р 26 . (72) В.П. Николаев и О.A. Шмидт (53) 615.373.3(088.8) (56) l. Шмидт О.A. и др. Взаимодействие вирусов и клешни:; Рига, Зинашне, 1977, 92-97.. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИ

ЧЕСКОГО ИИИУНОГЛОБУЛИНА К ВИРУСУ

ЗАБАДНОГО НИЛА, включающий приготов,ление видоспецифического антигена вируса Западного Нила, гипериммунизацию мышей этим антигеном, получение иммунной асцитной жидкости и выделение as нее иммуноглобулина, о т л ич а ю щ и-й с я тем, что, с целью повышения видовой специфичности иммуноглобулина, иммунизацию мышей проводят .видоспецифическим антигеном, остаточный вирус в котором инактивируют прогреванием в течение 20—

24 ч пои 36-37 С.

1102605

Изобретение относится к способу получения диагностических препаратов, содержащих иммуноглобулины и может быть использовано в вирусологической и эпидемиологической практике для выявления и одновременной идентификации 5 вируса Западного Нила и его антигенов прямым иммунолюминесцентным методом..

Известен способ получения диагностического иммуноглобулина к флавивирусам подгруппы денге, включающий fp приготовление антигена, иммунизацию мышей этим антигеном, выделение иммуноглобулина из асцитной жидкости мышей Kl) .

Однако известный способ не дает воэможности получить диагностический иммуноглобулин к вирусу Западного

Нила, так как видоспецифический антиген вируса Западного Нила содержит небольшое количество остаточного активного вируса, который при имму- 20 низации мышей размножается и вызывает в организме интенсивное образование грунпоспецифических антител, реагирующих с другими флавивирусами.

Белью изобретения является повыше 25 ние видовой специфичности иммуноглобулина к вирусу Западного Нила.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения диагностического иммуноглобулина к вирусу

Западного Нила, включающему приготовление видоспецифического антигена вируса Западного Нила, гипериммунизацию мышей этим антигеном, получение иммунной асцитной жидкости и выделение из нее иммуноглобулина, иммуни- 35 зацию мышей провОдят видоспецифическим антигеном, бстаточный вирус в котором инактивируют прогреванием о в течение 20-24 ч при 36-37 С.

Пример. Белых мышей - сосунков в возрасте 2-4 дней заражают в мозг вирусом Западного Нила (штамм.

Hp-91) . Заболевших животных усыпляют эфиром и извлекают их мозг с соблюдением правил асептики. Ткань мозга, 45 содержащую вирус Западного Нила, тщательно гомогенизируют в фосфатном. солевом буферном растворе рН 7,2

7,4 (на один мозг берут 0,9 мл этого раствора). К полученной суспензии 5р мозга добавляют двойной объем ацетоо на, охлажденного до 2-5 С. Смесь перемешивают 50-60 с и центрифъ гируют 5-7 мин при 2500-2700уи 2-5 С.

Жидкость пОлнОстью удаЛяют, а ОсадОк, 5 ресуспендируют в 0,15 M фосфатном солевом буферном растворе рН 7,2-7,4, взятом в количестве, равном объему исходной суспенэии мозга. Взвесь центрифугируют 30-35 мин при 3500—

4000ф и 2-5 С. Надосадочную жид- 6р кость, представляющую собой видоспецифический антиген вируса Западного

Нила, отсасывают. Затем для инактивации остаточного вируса ее прогревают 20-24 ч при 36-37 С. 65

Беспородным белым мышам массой

20-24 r два раза с интервалом в

6-7 дней внутримышечно (в заднюю лапку) вводят по 200 мкл смеси, состоящей из равных объемов видоспецифического антигена вируса Западного Нила и адъюванта следующего состава,вес.%: вазелиновое масло 90, безводный ланолин 10 и вакцина ББЖ

500 мг/л.

Через 3 недели после первичной иммунизации проводят реиммунизацию животных. При этом мышам вводят внутрибрюшинно через день видоспецифический антиген вируса Западного Нила в количествах 100, 200, 300, 400 и 500 мкл.

Через день после заключительной инъекции антигена мышам внутрибрюшинно вводят 200 мкл суспензии клеток асцит-саркомы TG/180, что приводит к накоплению в брюшной полости животных асцитной жидкости, содержащей иммуноглобулина.

По мере накопления (через 1525 дней после иммунизации) асцитную жидкость собирают путем пункции брюшной полости животных и с помощью центрифугирования (20-25 мин при 20002500 С) освобождают ее от сгустков фибрина и клеточных элементов.

Иммуноглобулин иэ асцитной жидкости выделяют осаждением этиловым алкоголем по Кону или хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.

Присоединение к иммуноглобулину флуоресцеинизотиоцианата проводят в щелочной среде при рН 8,9-9,0, температуре 2-5 С и постоянном помешивании реагентной смеси в течение 18 ч.

Содержание иммуноглобулина в реагентной смеси должно составлять 1-1,2%.

Флуоресцеинизотиоцианат берут из расчета 2-2,5 сг на 100 мг иммуноглобулина.

Очистку полученного люминесцирую« щего иммуноглобулина от свободного несвязавшегося с белком флуоресцениэотиоцианата осуществляют с помощью диализа против фосфатного буфера рН 7,2-7,4 с последующей хроматографией на колонке с Дауэксом lх4 или

Сефадексом Г-50.

Подлинность получаемого продукта подтверждают его титрованием с антигенами различных флавивирусов (контроль активности и специфичности).

Пример титрования диагностического люминесцирующего иммуноглобулина к вирусу Западного Нила.

Культуры клеток, чувствительные к флавивирусам (например, ВНК-21 или

СПЭВ), выращенные на стеклянных пластинках, помещенных в пробирку или флаконы с питательной средой, инфицируют различными флавивирусами..

Через 20-24 ч стеклянные пластинки с монослоем клеток отмывают от питательной среды 0,15 М раствором хлори1102605 да натрия, высушивают и фиксируют

15-20 мин холодным (2-5 C) ацетоном.

Люминесцирующий иммуноглобулин доводят до содержания белка 1%, добавляя 0,01 М фосфатный солевой буферный раствор рН 7,2-7,4 или концентрируя 5 препарат выпариванием. Далее из люминесцирующего иммуноглобулина готовят серию двукратных разведений на фосфатном солевом буферном растворе (от 1 4 до 1г128) . Каждое разведение смешивают с равным количеством альбумина, меченого родамином (производства ИЭИ им. Н.Ф.Раиалеи), взятого в рабочем разведении. Таким образом получают конечные разведения люминесцирующего иммуноглобулина от 1:8 до 1:256. Эти конечные разведения наносят тонким слоем на фиксированные препараты клеточных культур, инфицированных флавивирусами, и помещают их на 30 мин во влажную ка- 20 меру. Затем препараты ополаскивают водой, на 10 мин погружают в фосфатный солевой буферный раствор рН 7,27,4, снова ополаскивают водой и высушивают при комнатной температу- 25 ре. В заключение окрашенные препараты просматривают под люминесцентным микроскопом, используя водноиммерсионный объектив х70 и окуляр х5.

Регистрируют интенсивность свечения вирусных антигенов, локализованных в цитоплазме клеток препаратов, обработанных различными разведениями люминесцирующего иммуноглобулина.

Оценка активности и специфичности диагностического люминесцирующего 35 иммуноглобулина к вирусу Западного

Нила представлена в табл.1.

Иэ приведенных в табл.1 данных вид-: но, что испытанный образец диагностического люминесцирующего иммуноглобулина к вирусу Западного Нила имеет красящий титр 1:64 и слабо окрашивает или вообще не окрашивает антигены других флавивирусов. Такой препарат в рабочем разведении 1:32 может быть использован для выявления и одновре- 45 менно идентификации вируса Западного

Нила.

Пример использования диагностического люминесцирующего иммуноглобулина к вирусу Западного Нила для одномоментного выявления и идентификации этого возбудителя .

Культуры клеток-, выращенные на стеклянных пластинках, заражают различными флавивирусами. Через 20-24 ч стеклянные пластинки с клетками отмывают, клетки фиксируют ацетоном.

На монослой клеток наносят диагности« ческий люминесцирующий иммуноглобулин к вирусу Западного Нила, взятый в рабочем разведении (1:32) и содержащий рабочую дозу альбумина, меченого родамином. Через 25-30 мин клетки отмывают, высушивают и просматриsam под люминесцетным микроскопом, отмечая препараты со светящимися клетками., Эксперименты показывают, что клет« ки со светящейся цитоплазмой имеются в культурах, зараженных вирусом Западйого Нила, а в культурах, зараженных вирусами японского энцефалита, энцефалита Сент-Луис, желтой лихорадки, клещевого энцефалита, денге тина 2, незараженных, подобных клеток нет.

Результаты сравнительных испытаний иммуногиобулина к вирусу Западного Нила, полученных предлагаемым и известным способами в различных серологических местах, представлены в табл. 2.

Данные, приведенные в табл,2, по-. казывают, что иммуноглобулин, полученный предлагаемым способом, имеет более вЫсокую видовую специфичность по сравнению с иммуноглобулином, приготовленным известным способом.

Этот вывод вытекаеТ as сопоставления гомологичных титров (с антигеном вируса Западного Нила) и гетерологичных титров (с антигенами других флавивирусов, наиболее близких в антигенном отношении к вирусу Западного Нила).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить видовую специфичность иммуноглобулина в 8-16 раз и точнее идентифицировать вирус Западного Нила среди других флавивирусов.

1102605.Таблица

Интенсивность свечения вирусных антигенов в препаратах, обработанных разведениями иммуноглобулина

Антигены вирусов е «« ь«юч«е« « мю

1!8 lil6 1 32

1 64 1:128

1:256

Западного

Нила

4+ 4+

Японского энцефалита 2+ l+

Энцефалита

Сент-Луис l+

Ильеус

Денге типа 2

Желтой лихорадки

Клещевого энцефалита

Т а б л и ц а 2

Обратные величины титров антител s серологических местах

Антигены вирусов

Реакция тормо.жения непрямой

- Западного

Нила

512

512

Полученный по предлага- Японского емому спосо- энцефалита бу

Энцефалита

Сент-Луис

32 512

128

512

Полученный . Японского .по известно- энцефалита 512 му способу

Энцефалита

Сент-Луис 8

256

Илъеус

ВНИИПИ Заказ 4867/6 Тираж 688 Подписное

« «« «Ф «««

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная,4

Испытуемый иммуноглобулин

Ильеус

Западного

Нила

Реакция связывания

Прямой- метод флуорес цирующих антител