Способ выделения микроорганизмов из суспензий

 

1. СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ СУСПЕНЗИЙ путем пропускания исследуемого материала над мембраной , сорбции и последующей десорбции микроорганизмов, отличающийс я тем, что, с целью повьппения сохранности биологической активности целевого продукта, суспензию пропускают над поверхностью мембраны со скоростью тангенциального потока 0,120 см/с при перепаде давления на мембране 0,01-1,0 мПа, после сорбции микроорганизмов жидкую фазу удаляют и микроорганизмы десорбируют с помощью тангенциального потока буферного раствора при скорости 20-200 см/с и отсутствии перепада давления на мембране или периодической подачи на мембрану импульсов отрицательного давле (Л ния длительностью 0,01-100 с с интервалом между импульсами 0,1-100 с. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью ускорения десорбции, поток буферного раствора барботируют.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

09) (И) зВвС12Я700

ГОсудАРстВенный номитет сссР по делАм изоБРетений и отнРытий

1 ф- ° !

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1 . 3

H ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (54) (57) 1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ СУСПЕНЗИЙ путем пропуска(21) 3455610/28-13 (22) 17. 06. 82 (46) 07.08.84. Бюл. № 29 (72) В.П. Жемков, В.И. Громов, Н.Б. Иванов, Г.А. Меркулов, Ю.В. Лапыкин, Г.Д. Самохина, А.Н. Черкасов, В.А. Валов, Б.Г. Гриненков и Л.А. Мартемьянов (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов (53) 576.858(088.8) (56) 1. Заявка Японии ¹ 53-62891, кл. 36(2) С1, 05.06.78.

2. Goyal Sagar М., Hanssen Heury, Cerba Charles P. — Simple method for

the concentration of influensa virus

from allantoic fluid ou microporous

filters, Appl, and Environ Microbiology. 1980, 39, ¹ 3, 500-504 (прототип). ния исследуемого материала над мембраной, сорбции и последующей десорбции микроорганизмов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения сохранности биологической активности целевого продукта, суспензию пропускают над поверхностью мембраны со скоростью тангенциального потока 0,120 см/с при перепаде давления на мембране 0,01-1,0 мПа, после сорбции микроорганизмов жидкую фазу удаляют и микроорганизмы десорбируют с помощью тангенциального потока буферного раствора при скорости 29-200 см/с и отсутствии перепада давления на мембране или периодической подачи на мемб-I рану импульсов отрицательного давления длительностью 0,01-100 с с интервалом между импульсами 0,1-100 с.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью ускорения десорбции, поток буферного раствора барботируют.

1 1106

Изобретение относится к микробиологии и вирусологии и касается выделения микроорганизмов из суспензий, Известен способ разделения биологических суспенэий с помощью процессов фильтрации через пористые мембра" ны (13, Однако пористая мембрана закупоривается крупными частицами, задерживает фильтрацию мелких частиц, что снижает производительность этого способа.

Известен также способ выделения микроорганизмов из суспензий путем пропускания исследуемого материала l5 над мембраной, сорбции и последующей десорбции микроорганизмов (2 3, Однако известный способ не обеспечивает высокой сохранности биологической активности целевого продукта.

Целью изобретения является повышение сохранности биологической активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу вццеления микроорганизмов из суспензий путем пропускания исследуемого материала над мембраной, сорбции и последующей десорбции микроорганизмов, суспенэию пропускают над поверхностью мембраны со

30 скоростью тангенциального потока О, 120 см/с при перепаде давления на мембране 0 01-1,0 мПа, после сорбции микроорганизмов жидкую фазу удаляют и микроорганизмы десорбируют с помощью тангенциального потока буферного раствора при скорости 20-200 см/с и отсутствии перепада давления на мембране или периодической подачи на мембрану импульсов отрицательного давления длительностью 0,01-100 с

40 с интервалом между импульсами 0„1—

100 с.

Кроме того, с целью ускорения десорбции, поток буферного раствора

45 барботируют.

Способ осуществляют следующим образом.

Биологическую суспензию (БС) пропускают над обычными мембранами со скоростью тангенциального потока

50 (вдоль поверхности мембраны) 0,120 см/с и перепаде давления на мембране 0,01-1 мПа за счет гидродинамических сил, обусловленных потоком через поры, крупный компонент удержи- 5 вается на поверхности мембраны, в то время как мелкий компонент частично фильтруется через пори и частично

833 2 уносится тангенциальным потоком. Для полноты осаждения крупного компонента раствор, прошедший через фильтрующий аппарат, рециркулируют (воэвращается в исходную емкость) в течение 1-3 ч.

После завершения процесса посадки часть раствора, содержащую мелкий компонент, сливают, а частицы крупного компонента десорбируют буфером с рН в пределах б,5-7,5. Для этого поток фильтрата перекрывают, тем самым прекращается действие давления жидкости на крупный компонент БС.

Для полноты смыва скорость тангенциального потока буфера увеличивают до 20-200 см/с. Время элюции 1030 мин. Проведенные эксперименты показали, что более эффективная посадка крупного компонента дос:игается при предварительной очистке исходной

БС на фильтре Петрянова, а смыв этого компонента облегчается при применении барабана (введение в буфер пузырьков газа — азот, воздух). Обнаружено также, что повышение скорости

1 фильтрации и прохождения мелкого компонента в фильтрат достигаются в том случае, если на мембрану подается не посто>.нный, а пульсирующий перепад давления.

Оптимальные результаты достигаются при длительности действия импульсов 0,1-100 с и промежутков между импульсами О,1 †1 с. Импульсы давления могут подаваться как в направлении фильтрации, так и обратно ему.

П р и и е р 1, Фильтрация проиэводится по схеме, в которой используется фильтрационный модуль типа "фильтрпресс" с рабочей поверхностью 3760 см i

Модуль укомплектован ацетатцеллюлоэными мембранами со средним радиусом пор 1000 А (мембраны "Биопор" производства ВНИИОЧБ). В качестве БС используется вируссодержащая аллантоисная жидкость (ВАЖ) с. вирусом А2 (Техас). Скорость тангенциального потока фильтруемой жидкости на стадии посадки 20 см/с, dp = 1 МПа. Смыв вирусных частиц после посадки на мембраны осуществляется 0,5 М трис-буфером, рН =

7,2 при скорости потока буферного раствора 200 см/с. Процесс посадки вируса проводится в течение 3 ч. Исходный объем ВАЖ 4000 мл. Титр РГА/0,2 исходной ВАЖ 1:1024, содержание белков 2000 мкг/мл (по Лоури).

Конечный объем концентрата (после посадки и смыва буферным раствором, 1106833 время смыва 30 мин) 400 мл, титр

РГА/0,2 концентрата 1:16000, содержание белков 2000 мкг/мл. Сохранение активности вируса (в процентах к исходной ВАЖ) 1007.. Увеличение удельной 5 активности (по отношению к исходной

ВАЖ) 10 раэ.

Пример 1а. Приборное оформление опыта такое же, как и в примере I. 10

Фильтрационный модуль укомплектован мембранами "Биопор" со средним о радиусом пор. 1000 А. Биологическая суспензия — вирус Ньюкасловской болезни (ВНБ). Исходная активность 15

А = 7,5 1/мл. Исходный объем БС

5000 мл. Посадка проводится в течение

2,5 ч при скорости тангенциального потока БС 0,07 см/с, йр = 0,01 MIIa.

Смыв вируса после посадки на мембра- 20 не осуществляется 0,05 М трис-буфером, рН = 7,5, при скорости 20 см/с. Конечный объем концентрата (после посадки и смыва) 490 мл. А концентрата

35 I/ìë, А фильтрата 40 1/мл. Электронная микроскопия показывает наличие большого количества вирусных частиц в фильтрате. Сохранение активности вируса 47Х.

Пример 2. Приборное оформле- 30 ние опыта такое же, как и в примере 1.

Фильтрационный модуль укомплектовывается мембранами "Буопор" со средним радиусом пор 2000 А. Биологическая суспензия Serracia marcescens штамм В-10, М-I, число клеток 3 10

1/мл, активность по ферменту (эндонуклеазе) 2000 1/мл (эндонуклеазная активность А определяется методом

Мак-Карти). Посадка проводится в те- 40 чение 3,5 ч при скорости тангенциального потока фильтруемой жидкости

100 см/с, d p = МПа. Скорость смыва клеток после посадки на мембрану

200 см/с при рН = 6,5. Исходный объем 45

БС 4000 мл. В обесклеточенной жидкости А 2000 1/мл, а электронная микроскопия показывает практически полное отсутствие клеток. Сохранение эндонуклеазной активности 100 .

Пример 3. Приборное оформление опыта такое же, как и в примере

1.

Фильтрационный модуль укомплектовывается мембранами Биопор" со срецо ним радиусом пор 1000 А. Биологическая суспензия — вирус Ньюкасловской болезни (ВНБ). Исходная активность

А = 7,5 1/мл (A определяется по максимальному разведению при кратности

1: 10, обеспечивающей 507. - гибель

10-ти дневных куриных эмбрионов) .

Исходный объем БС 3500 мл. Посадка проводится в течение 3 ч при скорости тангенциального потока БС

0,1 см/с, ар = 0,01 МПа. Смыв вируса после посадки на мембране осуществляется 0,05 М трис-буфером, рН = 7,5, при скорости 20, 0 см/с. Конечный об ьем концентрата (после посадки и смыва)

400 ил, А концентрата 70 1/мл, А фильтрата 1 1/мл. Электронная микроскопия показывает отсутствие вируса в фильтрате. Сохранение активности вируса 1007..

Пример 4. Приборное оформление опыта и тип БС такой же, как и в примере 1. Начальный объем БС

4000 мл, фильтруется через слой фильтра Петрянова со средним размером пор 1-10 мкм. Титр РГА после такой предфильтрации полностью сохраняется, содержание белков сохраняется. Время посадки 2,5 ч. Содержание белка в концентрате (после посадки и смыва буфером — условия опыта такие же, так и в примере 1)

2000 мкг/мл, титр РГА/0,2 концентрата 1:16000. Сохранение активности вируса 1007.

Пример 4а. Приборное оформление опыта, мембраны и тип БС такой жс, как и в примере 1а. Начальный объем БС 5000 мл. Исходная активность

А = 7 I/ìë. Посадка проводится в течение 2 ч при скорости тангенциаль,ного потока БС 22 см/с, а р = О, О1 МПа .

Смыв вируса после посадки на мембраны осуществляется 0,05 М трис-буфером, pH = 7,5, при скорости 20 см/с. Конечный объем концентрата (после посадки и смыва 500 мл. А концентрата 40

1/мл, А фильтрата 30 1/мл.

Электронная микроскопия показывает наличие большого количества вирусных частиц в фильтрате. Сохранение активности вируса 57X..

Пример 5. Приборное оформление опыта и биологическая суспензия такая же, как в примере 1. Однако в линию фильтрата подключается перистальтический насос с одним роликом. Направление вращения — навстречу потоку фильтрата. В результате периодически (половина времени полного оборота) создается давление в зоне фильтрата, превышающее давление над фильтрующей мембраной и, как следствие, поток из

Составитель А. Маныкин

Редактор Г. Волкова Техред O.Heöå Корректор Д. Мельниченко

Заказ 5724/20

Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 1106833 d зоны фильтрата проходит сквозь мембра- как и в примере 1, только в процессе ну в зону концентрата. смыва буферный раствор перемешивается

Таким образом, решаются две зада- с пузырьками газа (воздух, азот) в чи — очистка пор мембран от примесных объемном соотношении 507.. частиц (белков) и облегчается смыв g Время смыва 10 мин. Титр РГА/0,2 крупнодисперсных частиц (вируса) с концентрата 1: 16000, содержание белков поверхности мембраны. Программное 2000 мкг/мл. Выход по РГА (в проценустройство, управляющее работой на- тах к исходному ВАЖ) 100 . Увеличение соса, позволяет осуществить время удельной активности (по отношению к действия импульсов давления в диапаэо- 10 исходной ВАЖ) 10 раэ. Сохранение акне 0,1-100 с и периодичность следо- тнвности вируса 1007. вания импульсов 0,1-100 с.

Результаты концентрирования такие Предлагаемый способ очистки концентже,. как и в примере 1. Однако, если рирования позволяет сохранить 100Х в примере 1 проницаемость по воде 15 биологической активности выделяемых мембраны в фильтрующем аппарате падает частиц при степенях концентрирования от опыта к опыту в 1,5-2 раза от пре" до 20-25 раэ при отсутствии концентри дыдущей, то в этом случае она практи- рования белка, работать при испольэочески остается неизменной. ванин широкого класса мембран, диаметр

Сохранение активности вируса 1003. 20 пор которых подбирается исходя из усПример 6. Приборное оформле- ловим полного задержания крупнодисние, тип БС и условия опыта такие же, персных частиц.