Способ определения активности препаратов вирусов ядерного полиэдроза и гранулеза

 

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ВИРУСОВ ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА И ГРАНУЛЕЗА, предусматривающий электронное микроскопирование супервириокапсидов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и достоверности способа/ из супервириокапсидов готовят ульратонкие срезы, при микроскопировании которых подсчитывают количество нуклеокапсидов и по количеству последних судят об активности ггрюпарата. 2.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что перед приготовлением среза супервириокапсиды фиксируют , обезвозживают, заключают в эпоксидную смолу, а перед микроскоСО пированием среза производят их контрастирование .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) 3(Я) С 12 Н 7 00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3482179/30-15 (22) 17.08.82 (46) 30 ° 09.84. Бюл. Р 36 (72) М.Г.Чухрий, В.В.Гулий, Э.Ж.Симонова и Н.И.Никитина (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологических методов зашиты растений и Всесоюзный научно-исследовательский институт микробиологических средств защиты растений и бактериальных препаратов (53) 576,858.11 (088.8) (S6) 1. Зариньш И., Путнаэрглис Э °

Оценка способов определения концентрации вирусных препаратов.

Труды JICXA, вып.164, 1978, с.47-55.

2. Тарасевич Л.М. и др. О смешанной вирусной инфекции у озимой совки . Сб. Микроорганизмы и вирусы, Кишинев, "Штиинца", 1979. (54) (57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ВИРУСОВ ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА И ГРАНУЛЕЗА, предус- матривающий электронное микроскопирование супервириокапсидов, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения точности и достоверности способа, из супервириокапсидов готовят ульратонкие срезы, при микроскопировании которых подсчитывают количество нуклеокапсидов и по количеству последних судят об активности препарата.

2.Способ по п.1, о т л и ч а ю шийся тем, что перед приготовлением среза супервириокапсиды фиксируют, обезвозживают, заключают в Е эпоксидную смолу, а перед микроскопированием среза производят их контра стирование. 1116059

Изобретение относигся к защите растений, а именно к определению качества энтомопатогенных вирусных препаратов, применяемых в борьбе с вредными насекомыми сельскохозяйственных культур и лесных насаждений, и может быть использовано в. производственных лабораториях, работающих с энтомо, патогенными вирусными препаратами.

Известен способ определения качества вирусных препаратов, включаю- 10 щий подсчет количества супервирионных капсидов (СПВК) — полиэдров, тел включенный в камере Горяева, предназначенной для подсчета элементов крови ttJ 15

Наиболее близким к предлагаемому является способ, предусматривающий электронное микроскопирование супервириокапсидов. При этом подсчитывают супервириокапсиды в 1 мл исходной суспензии по формуле:

A.Â.0.Х, где А — число супервирио.капсидов в поле зрения микроскопа;

В - число полей зрения микроскопа при данном увеличении (оно опреде- 25 ляется, отклонением сеточки

) поля зрения

Π— разведение суспензии; Х вЂ” коэффициент, показывающий во сколько раз 1 мл суспензии больше количества суспензии, нанесенной на сеточку(г).

Согласно известным способам активность вирусного препарата определяется по количеству супервирионных капсидрв, которые не являются непосредственными носителями вирусной инфекции и, следовательно, способ не является достаточно точным и достоверным, так как количество полиздров еще не обуславливает актив- 40 ности препарата.

Цель изобретения — повышение точности и достоверности способа.

Поставленная цель достигается тем,что согласно способу определе- g5 ния активности препаратов вирусов ядерного полиэдроза н гранулеза, предусматривающему электронное микроскопирование супервириокапсидов, из супервириокапсидов готовят ультра- 50 тонкие срезы, при микроскопировании которых подсчитывают количество нуклеокапсидов и по количеству последних удят об активности препарата.

Перед приготовлением среза супервириокапсиды фиксируют, обезвоживают, заключают в эпоксидную смолу, а перед микроскопированием среза производят их контрастирование, Пример. Опредег.яли количества 60 нуклеокапсидов в вирусном препарате в процессе его хранения в холодильнике при +4 С, в течение 24мес., для чего брали 10 мл жидкого вирусного препарата ВПРИН-ЭКС, фиксировали его 65 в 2Ъ-ном растворе глутарового альдегида 2,5 ч и в растворе осьмиевой кислоты 1,5 ч.:при комнатнрй температуре. Фиксированный материал промывали в какодилатном буфере три раза по

15 мин и обезвоживали ацетоном в серии возрастающих концентраций от 30 до 100 Ъ. Фиксированный и обезвоженный материал заключали в эпок 812 °

Проводили ультратонкие срезы с помощью ультрамикротома, которые контрастировали 15 мин 2 Ъ-ным водным раствором уранилацетата и 5 мин цитратом свинца по Рейнольдсу.. В электронном микроскопе определяли диаметр ультратонких срезов и количество нуклеокапсидов в них, Количества нуклеокапсидов в целом СПВК подсчитывали по формуле

N й, где N —. число нуклеокапсидов в одном

СПВК3

D — средний диаметр СПВК;

h — средняя протяженность нуклеокапсида вдоль высоты цилиндра;; вЂ,число нуклеокапсидов на одной плоскости среза через СПВК.

В процессе хранения часть нуклеокапсидов разрушается и на их месте остаются электронно-прозрачные участки такой же формы и величины как и вирианы или поливирионы. После 12 мес хранения вирусного препарата ВИРИН3КС при — 4 С сохраняются 70 Ъ нуклео+ o капсидов (табл. 1) .

Та блица 1

Время, мес

Количество обнару женных нуклеокапсидов,. Ъ

0 100,0

1 97,1

2 94,2

3 91,5

4 88,8

5 86,2

6 83,7

81,2

8 78,9

9 76,5

10 74,3

11 72,1

12 70,0

Одновременно были поставлены биологические опыты в лабораторных и производственных условиях для оценки указанных препаратов на тестнасекомых. Качество препаратов, в частности инсектицидная активность, определялось по стандартной методике и выражалось в летальной концентрации препаратов, вызывающей 50 Ъ гибели тест-насекомого (ЛК 0 ) при свп бодном поглощении корма (табл.2) .

1116059

Та блица 2

По прототипу

По предлагаемому способу

Время

I,хранеКоличе ст =, во нуклеокапсидов

Количество нуклеокапсидов

Смертность тестнасекомых, Ъ

Количество

Количество СПВК ния, мес

СПВК

0 4х10

1х10

50 1х15

5х10 бх10

6 2х10 5х10

5х10 50

12 2х10

Цэодолжение табл 2

По базовому способу

Смертность тест-на секомых

Врем хран ния, мес

Количество Количество Смертность нуклеокапси дов тест-насекомых, СПВК

1х10

5х10

6х10

50

12..

50

Сост ави тель С . Светышев

Редактор Т. Веселова Техред N. Гергель Корректор М. Максимишинец

Заказ 6 865/28 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент,.r.Óæroðîä, ул.Проектная,4

Как показывают данные табл.2, точность определения активности вирусного препарата по предлагаемому способу повышается за счет выявления 49 непосредственных носителей вирусной инфекции — нуклеокапсидов, присутствующих в СПВК. Так, например, в титре полиэдров 1х104 содержатся

4х10 нормальных йуклеокапсидов, обеспечивающих 50 Ъ гибели тестнасекомых,в то время как по прототипу эту же гибель обеспечивает титр 1х10 СНВК, а по базовому способу 1х10а СПВК. По мере снижения точности и достоверности способа возрастают определяемые величины требуемых титров СПВК для достижения

50 Ъ гибели тест-насекомых. Следовательно, известные способы, не давая точного определения истинных носителей инфекционного начала.— нуклеокапсидов, приводят к завышенным результатам определений по количеству СПВК и к неоправданному расходу препарата, необходимого для достижения поставленной цели.