Способ получения высокоурожайных клонов миксо-и парамиксовирусов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОУРОЖАЙНЫХ КЛОНОВ цiкco- и ПАРАМИКСОВИРУСОВ путем заражения клеточной культуры вирусными штаммами, инкубирования с последующим титрованием, анализом антигенной структуры и отбором высокоурожайных вирусных; клонов, о т л и .чающийся тем, что, с целью ускорения процесса, заражение ccynieствляют с множественностью инфекции 1-100 ВДср ча. клетку, инкубируют в течение 4-12 ч, затем повторно заражают клеточную культуру отобранным по результатам титрования на куриных эмбрионах вирусным клоном, отбирают О 9 культуральную жидкость, реклонируют ее на куриных эмбрионах и затем выби (Л рают высокоурожайный вирусный клон.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

scag> С 12 1 7 00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКУП ИЙ (21) 3579301/28-13 (22) 12.04.83 (46) 23.08.84. Бюл. Р 31 (72) А.А.Соминина, Л.П.Сухобаевская, Т.П.Лисок и Н.Л.Корчанова (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт гриппа (53) 576.858(088,8) (56) 1. Неклюдова Л.И. и др ° Сравнительное определение клеточной реактивности при инфекции вирусом гриппа

А(ГЗН2). — "Вопросы вирусологии", 1976, 3, с. 276-282.

2. Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. — "Вопросы вирусологии", 1977

4, с. 387-395 (прототип).

„„SU„„1109435 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОУРОЖАЙНЫХ КЛОНОВ И1КСО- И ПАРАИИКСОВИРУ"

С0В путем заражения клеточной культуры вирусными штаммами, инкубирования с последующим титрованием, анализом антигенной структуры и отбором высокоурожайных вирусных клонов, о т л и,ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения процесса, заражение осуществляют с множественностью инфекции

1-100 ИД, на клетку, инкубируют в течение 4-12 ч, затем повторно зара. жают клеточную культуру отобранным по результатам титрования на куриных эмбрионах вирусным клоном, отбирают культуральную жидкость, реклонируют ее на куриных эмбрионах и затем выбирают высокоурожайный вирусный клон.

1 11094

Изобретение относится к вирусоло-.

1 ни и может бьггь использовано при гтоДготовке вакцинных и диагностических штаммов вирусов.

Известен способ повышения репро5 дукции ви1>усов гриппа путем последовательного многократнот о пассирова-. йия вируса в исследуемой культуре (.11.

Однако по этому способу только часть штаммов вируса григ,:па адаптируется к клеточным культурам.

Паиболее близким к изобретепию является способ получения высокоурожайных клонов миксо- и парамиксовирусов путем заражения клеточной культуры вирусными штаммами, инкубирования с последующим титрованием, анализом антигенной структур > и отбором высокоурожайных вирусных клопов Г2).

Однако известный способ сложен в осуществлении.

Целью изобретения является ускоре не процесса.

Цель достигается тем, что согласно способу получения высокоуро>кайных клонов миксо- H парамиксовирусов путем заражения клеточной культуты вирусными штаммами, инкубирования с последующим титрованием, анализом

ЗО антигенной структуры и отбором высокоурожайных вирусных клонов, заражение осуществляют с множественностью инфекции 1-100 ИД на клетку, инкубируют в течение 4-12 ч, затем повторно заражают клеточную культуру отобранным по результатам титровапия на куриных эмбрионах вирусным клоном, отбирают культуральную жидкость,,>еклонируют ее на куриных эмбриопах и затем выбирают высокоурт>жайный вирусный клон.

Способ осуществляется следующим образом.

Клеточную культуру заражают массивной дозой одного вируса (1—

100 ИД „/клетку), по завершении эта-!

>0 па адсорбции — проникновения вируса в клетки — проводят многократную отмывку культуры буферным раствором или средой, затем в зараженную культуру вносят питательную среду, культуру инкубируют при 37 С, начиная с 4 и до 12 ч, после зарал:ения (в течение первичного цикла репликации) извлекают пробы культуральной жидкости, этот материал клонируют предельными разведениями на куриных эмбрионах или методом бляшек на кле35

> точных культурах цля выделе:и-:я вибри онов, дающих вирусное потомство с наиболее высокой репродукционной активностью. Полученные субпопуляции однократно реклонируют.

П р H м е р 1. Получение высокоурожайного клона вируса гриппа

Л (Ленинград) 385/80 для приготовления опытных серий гриппозной тканевой вакцины.

В качестве исходного материала для получения высокоурожайного для клеточной куль>туры из почек телят вирусного клона использовали вакцинный штамм А(Ленинград)385/80т, предназначенный для производства инактивировапной аллантоисной гриппозной вакцины.

Клеточную культуру из 7о=-ек телят, выращенную на 10 пробирках в среде

Игла с 107.-ной сыворотки крупного рогатого скота, однократно отмывали

cp >дой И "а От сьтворо ктл Б!тр> с (титр-10".ЗИД „/0,2 мл) в 10 раз разводили средой Игла. Клеточные культуры заражали разведенным вирусом (по

1 мл на пробирку, множественность инфицирования — 10 ЭИ1Д /клетку) и помещали в термостат при 37 С.

Через 1 ч вирус удаляли„ культуры отмывали трижды теплой средой Игла (по 5 мл) от не адсорбировавшегося вируса, после чего вносили ту же среду (по 1 мл) и культуры помещали в термостат„

Через 2,4,.б,8 и 10 ч после заражения собирали формирующиеся субпопуляции вируса. Для этого ;а указанных сроках культуральную жидкость из 10 прсбирок полностью отсасывали, а в пробирки с культурой вносили по I мл с:вежей тeïëoH среды, Собранные популяции подвергали титрованию на куриных эмбрионах с 10 " Io 10 используя по 5-30 эмбрионов на каждое разведение. Исходный зара>каloLIHH вирус титровали с 10 qo 10

Результаты титрования учитывали через +8 ч инкубации курин1>гх эмбрионов при 37 С.

Первичный учет зак.почался в определении присутствия гемагглютининов

B каждом .и"з зараженных эмбрионов.

Содержание инфекционного вируса в субпогтулятллх, собранных через 2, 1, б, 8 >т 1 0 >-I IIOCJ!p ЗатражЕ!IHSI ло т,2 5,2; 4,1; 2,8 и А>2 Э™",, /

/0,2 мл. Первичный цикл гтепродт кции с выходом HíôåêöHoI:Hот о пото к.тва

1109435 завершен через 4 ч после заражения (увеличение титра на 1 08 ЭИД /

/О,R мл) .

Для определения репродукционной активности вирусов в составе исходной популяции и субпапуляции вновь сформированного вирусного потомства дополнительно определяли титры ГА в положительных по РГА. пробах аллантрисной жидкости, собранной из кури- 10

I ных эмбрионов, зараженных вирусом в дозе 10 и 10 ЭИД

Наиболее репродуктивные вирионы (титр ГА — 1:2048) содержались исключительно в 4- и 6-часовых субпапуля- 15 цих и не обнаруживались при тех же условиях в составе исходного вируса и 8-10-часовых субпопуляций. Для получения чистых клонов пробу вируса с титром ГА 1:2048 из 4-часовой 20 субпопуляции подвергали реклонированию на куриных эмбрионах. В результате реклонирования содержание высокорепрадуктивных частиц в полученной субпапуляции резко повысилось (9Z 25 куриных эмбрионов содержали вирус с титром 1:2048, 17,87. — с титром

1:4096) °

Использование полученных высокорепродуктивных клонов для заражения клеточной культуры из почек телят позволило повысить титры ГА с 1:321: 128 до 1: 128-1: 1024, инфекционного вируса с 7,8 до 9,3

/0,2 мл. На материале повторных 130.

35 наблюдений рассчитаны средние геометрические титры инфекционного вируса и гемагглютининов, формирующихся после заражения клеточных культур исходным вирусом и высокорепродуктив- 4О ным клоном, полученным в результате разделения исходной популяции по скоростям репродукции. Титры гемагглютининов при использовании высакорепродуктивных клонов повышались в среднем 45 в 2,3 раза, инфекционного вируса в 31,6 раза.

Вся процедура получения высокоурожайного клона заняла 8 суток, в том числе: первичное заражение кле- 5О точной культуры вирусом, сбор субпопуляций и их титрование на куриных эмбрионах (1 сут); инкубация зараженных эмбрионов при 37 С (2 сут); учет результатов титрования и отбор высокоуражайных "скоростных вирионов вируса (1 сут); повторное заражение клеточной культуры высокоурожайным клоном и рекланирование собранной культуральнай жидкости на куриных эмбрионах (3 сут); учет результатов.и отбор высакаурожайных клонов (1.сут).

Итого 8 сут.

Полученный высакарепрадуктивный клон использован для полученич 65 л вирусной биомассы в клеточной культуре 1П в целях изготовления опытных серий тканевай инактигированной гриппозной вакцины.

П р и и е р 2. Получение высокоурожайного клона вируса гриппа A (Техас) 1/77 для приготовления тканевого гриппозного диагнастикума.

Клеточную культуру 1ПСК, выращенную на поверхности 4 матрасов емкостью 100 мл, заражали по 1 мл вируса в разведении 1:10, содержавшем

10 ЭИД /клетку. Через 1 ч после

« заражения вирус удаляли, культуры

3 раза отмывали фосфатным буферным раствором (па 10 мл), на монаслой наносили гипериммунную гамалогичную крысиную сыворотку (титр в РТГА

1:1280) па 1 мл в разведении 1:20.

Через 60 мин инкубации при 37 С сыворотку удаляли, манаслой трижды отмывали ат антител буфером, в каждый матрац вносили по 10 мл поддерживающей среды Игла. Через каждый час в течение первыхс 10 ч репликации, а также через 24, 48 и 72 ч после заражения из матрасов отбирали по

0,5 мл вируса, гомологичные пробы объединяли и использовали для титра" вания вируса на куриных эмбрионах (c 10 " до 10 ь ). О-обранное из матрасов количество среды восполняли добавлением аналогичного объема (0,5 мл) среды Игла, культуры вновь помещали в термастат.

Содержание вируса в культуральной жидкости в интервале 2 — 7 ч составляла 1,7-2,5 Eg ЭИД 0,2 мл. Отчетливое увеличение инфекционных титров (высвобождение вновь сформированного вирусного потомства вследствие завершения первичного репликативного цикла) отмечено через 8 ч после заражения (4,6 Eg ЭИД« /0,2 мл). Определение репродукционной активности вирианов в субпопуляциях вируса, полученных на разных стадиях репликативнаго цикла, показало, что высокорепрадуктивные частицы удается обнару-жить в составе 8-часовой пробы (время завершения первичного репликативнога цикла) и 10-часовой -пробы вируса (вскоре после завершения цик1109435 ла) в 11 и 16,7% от общего числа зараженных эмбрионов. Высокорепродуктинные частицы не удалось Обнару))з!Ть ни в одной из 6 проб, собранных да

3 а ) eplll . Iия цикла р епрадукц!и! BHp » са

Л(Техас)1/77 в клетках ИДСК, а TQкже на балее поздних стадиях репродукции (24, 48, 72 ч после заражения).

В результате реклонирования 8-часовой пробы на куриных эмбрионах полу- )0 е)1 !зысакоурожайный скоростной клан вируса Л(Техас) 1/77.

Изучение стабильности признака высокой репродуктивнасти полученногn :кло)!а вируса проведено на 10 )5 последовательных пассажах в))руса, выполненных на куриных эмбрионах и, ),)) С К . Пр и з и а к в ы с с к с и 1) епродуктивности сохранялся на протяжении 10 пассажей. Средний гесмстричсс- рб кий титр гемагггпотининов скаростпо-I с паT)IIQllтQ Вь!ше пс срQB"!СНH!о с ис ход)!ым в 3, 5 раза, инфекцисннсгo вируса — в 99,3 раза при репрадукц)п-; в клеточной культуре ЛДС1(, испальзо — g5 ванной г, качества системы для раздев

Jiс11ия пО!lуляIJHJI па скоростям репрО дукц)!и. Показатели репродукции скоростного" варианта вируса Л(Техас)

1/77» куриных эмбрионах IIOB) ))))QJI))c! по ат!!оше!!ию к исходному вирусу и 2 раза по титрам I A и в 8,9 раз по ш)фекционнсй активности, Полученный высокорепродуктивный клон вируса гриппа A(Texac)1//7 начи35 ная с 1980 г используется для приготовле)шя тканевых гриппозных диагност!)куь)ов в отделе экспериментальных препаратов ВНИИ гриппа в целях o() ec печеш!я диагностической работы опорнь)х баз Вс.есоюзпого и Региопальногс центров по гриппу. За этот период подготовлено 36220 мл тканевьгх гриппозных дигностикумов с титром в РГ»)

1: 64 — 1: 10?4 H титром в РСК вЂ” 1:81:32.

Пример 3. Клето !Ну)о культуру

Дc Tpойт-6 заражали парагриппîэным вирусом 3 типа при м ожественности инфекции 1 1ИД <о /клетку. Через 2 ч адсарбции при 37 С вирус удаляли, культуру обрабатывали иммунной сывороткой к вирусу парагриппа 3 типа (30 мин при 7 С), после сыворотку удаляли )ьонаслай три>кдь! Отмыва!1и фасфатным буферам, в культуру вносиги псддеря<НBающу)о среду Игла. Через

6, 12, 18 и 24 ч после заражения отбирали пробы культуральной жид:oc. ти, содержащей вновь сформированное вирусное потомство, которое титровали методом пляк. С этой целью десятикратными разведениями вирусаз (популяции через 6-24 ч после заражения) заражали культуры клеток, выращенные на боковой стенкс 50 мл матрацев.

Через час инкубации при 37 С вирус удаляли, монсслой покрызали первым агаровым покрытием, включаюшим среду )99.,0,9% агарсзу и 2,5% обезжиренное молоко. Через 4 сут инкубаQ ции при 37 С в инвсртирсванном паложснии на МОНОслсй наносили ВтоРае красящее агаровае покрытие, состояп)ее из 0,9% агарозы H нейтральногo красного (I:7500) Рсакци!о учитываг)и через 1 сут инкубации культур при 37 С. Определяли кол:-ячество и размер бляшек.

Инфекционные титры в пробах через

6, I2,18 и 24) ч после заражения составляли О, 10 9х10 5х10 ГИД /

5о

/0,,5 мл соответственно. При этом в 12 и 18-часовых пробах содержались вирионы, формирующие наиболее крупные бляшки, диаметром 3-3,3 мм (соответственно ь 15,2 и 6,5% от общегo чис;!а бляшек). Таких вирионoB »е удавалось обнаружить при титровании проб, палученньг на более поздних сроках культивирования (24 ч и позже). Реклонирование крупнсбляшечных вариантсв показало, что этот признак наследуется генстически. Сравнение репродукционной активности крупно, средне и мелкобляшечных вариантов показало, что крупнобляшечный BQpHQHT

ШБЗ и его производный Ш-ОБЗ, полученный в ре-ультате рекланиравания виру; са, обладспот повышенной репрадукцисннОй QKTHBHocTJ»)o (титры )!Нч)екцион ного вируса 6, 2-6,6 ГВБОЕ/0,5 мл по сравнению с 4, 2-5, 7 ГОБОЕ/0,5 мл у исходного вируса H 4,0 I) I; 80F. /

/0,5 мл у среднебляше"- ного варианта) .

Мелкобляшечные варианты обладали редуцированной способностью к репродукции (0-2,0,0g БОЕ/0,5 мл), Таким образам, крупнабляшечные клоны парагриппозного вируса 3 типа, выделяемые

I I . 11 исключительнО из ранних субпОпуляций вируса, облада)от -..oBüïUåííoé реп)родукцисп))ой активность)о что o!Ipe целяет целесообразность их использования для изготовления парагриппозчых антигенов и диагнастикумог.

Предлагаемый способ по сравнению с известным обеспечHBQBT значительное

1109435

Составитель А.Маныкин

Редактор С.Патрушева Техред Т.Фанта Корректор С.Шекмар

Заказ 6003/18 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãoðoä, ул.Проектная, 4 сокращение времени получения высокоурожайных клонов миксо- и парамиксовиф сов, что в условиях массового производства вакцин и диагностикумов дает существенный экономический .эффект.