Способ определения антигенов микобактерий в крови больных туберкулезом

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

° О«

РЕСПУБЛИК

А1

Ц1) А 61 К 39/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЬ9 КОМИТЕТ

ДО ИЗОБРИаНИЯМ И ЛНРЫтИЯМ

IlpH ГКНТ СССР

1 (21} 3451936/13 (22} 08.06.82 (46) 23.01 ° 92. Бюл-. N 3 (71) Центральный научно-исследовательский институт .туберкулеза

{72) А.Г.Хоменко, М.М.Авербах, P.Ю:Романова, Л.Г.Горина и В.И.Лит,винов (53) 615.373.3(088.8) (56) Романова P.N. Горина fl.Г. Исследование реакции агрегатагглютинации для определения туберкулезных антигенов. Тез.докладов сьезда фтизиаторов Закавказья. Ереван, 1980, 178" 179.

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно. к методам иммунодиагностики инфекционных заболеваний. Оно может быть использовано в медицинской практике для диагностики самых различных заболеваний инфекционной природы.

Известен способ определения антигенов микобактерий в крови больных туберкулезом путем исследования сыворотки крови в реакции агрегатагглютинации со специфическими антителами.

Однако известный способ недостаточно точен (504), поскольку свободные антигены B крови выявляются редко так как они связаны B иммунные комплексы.

Целью изобретения является повы" шение точности определения антигенов микобактерий.

Указанная цель достигается тем, что в способе определения антигенов

„SU„1123128 г (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ МИКОБАКТЕРИИ В КРОВИ БОЛЬНЫХ

ТУБЕРКУЛЕЗОМ путем исследования сыворотки крови в реакции агрегатагглютинации со специФическими антителами, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, перед постановкой реакции агрегатагглютинации исследуемую сыворотку обрабатывают 0,2 М глицин-НС1-буфером при рН 2,0"2,4 в течение 30 мин при 37 С, затем сыворотку пропускают через,сеФадекс

I-200 и элюируют тем же буфером. микобактерий в крови больных туберкулезом путем исследования сыворот. ки крови в реакции агрегатагглютинации со специфическими антителами перед постановкой реакции агрегатагглютинации исследуемую сыворотку обрабатывают 0,2 М глицин-HCl-буфе" ром при рН 2,0-2,4 в течение 30 мин при 37 С, затем сыворот ку пропускают через сефадекс С-200 и элюируют тем же буфером.

Способ осуществляется следующим образом.

Производят забор крови обслелуемого больного для получения сыворотки. Проводят диссоциацию циркулирующих иммунных комплектов (ЦИК}.

Осуществляют определение антигенов реакцией агрегатагглютинации.

Диссоциацию циркулирующих иммунных комплексов с последующим опре" делением антигенов проводили с использованием 0,2 М глицин-НС1-буФе1Е23Е28. Ра РН 2,0-2,4, который добавляли к испытуемой сыворотке крови (1:1).

После инкубации в течение 30 мин при

37о С образцы наслаивали на колонку и уравновешивали этим же буфером.

Дальнейшее разделение проводили путем гель-фильтрации на сефадексе

G--200 .

Элюацию проводят этим же 0,2 М глицин-HCl-буфером. Собирают фракцию (по 1 мл) и после нейтрализации бикарбонатом натрия каждую из собранных фракций исследуют на содержание бактериального антигена в реакции агрегатагглютинации, а затем вычисляют суммарный титр антигена (по всем пробам) °

При постановке реакции агрегатагглютинации сыворотку больного (там, где ищут антиген) добавляют к взвеси эритроцитов, обработанных глютаральдегидом (ГЛА) и агрегированной иммунной сывороткой против микробов-возбудителей болезней легких. В этой реакции при определении антигенов используют эритроциты человека 0(1)группы Rh-.ÝÐèтроциты, отмытые от сывороточных белков и консерванта физиологическим раствором РН 7,0 (до полного отсутствия реакции ha белок с 503" ной трихлоруксусной кислотой в промывной жидкости), суспендируют в двукратном объеме физиологического раствора и добавляют к ним 253-ный раствор ГЛА. После трехчасовой инкубации при 37оС эритроциты отмывают 4 раза физиологическим раствором ресуспендируют в нем же и вновь добавляют ГЛА до 0,254-ной концентрации (для хранения в активированном состоянии), Для агрегации на эритроцитах отбирают сыворотки, полученные иммунизацией кроликов убитой культурой каждого из микробов: пневмококка (I, II иХХ? серотипов), патогенного стафилококка и гемолитического стрептококка, разрушенной культурой живых микобактерий БЦЖ„ которые со своим специфическим антигеном в реакции преципитации давали титр не менее 1:18. Для поликонденсации к 1 мл этой сыворотки добавляют 0,08 мл 1,53-ного раствора ГЛА на физиологическом растворе .и инкубируют в течение 1 ч при 37 С. о

1 мл 8 -ной взвеси стабилизированных эритроцитов после отмывания добавления к сыворотке больного сенсибилизированных эритроцитов и ин" кубации в течение 3 ч при 37 С.

Исключение любого . из вышеуказанных приемов не позволит получить ии" кобактериальные антигены. Изменение вышеуказанных приемов, например замена глицин-.HCl-буфера на фосфатный, изменение полной силы буфера, изменение РН буфера и кислую или щелочную сторону, использование сефадекса с другими размерами частиц, изменение условий и температуры, контакта сыворотки крови с глицин-НС1-буфером, количества полученных проб, не позволяет получить или приводит к Резкому снижению количества получаемых вэлюате микобактериальныхантигенов, как показано в табл.1-4.

Следовательно, наиболее оптимальным является РН 2,0 и до 2,4.

Использование колонки Размером

25 ° 1,0 см является достаточным для хроматографии 0,5 мл сыворотки.

Пример 1. Больной К-в по4 ступил в отделение дифференциальной диагностики с подозрением на туберкулез легких. У больного взято 2,5 мл крови для исследования, из которой общепринятым способом получают сыворотку (1,0 мл) . При постановке комплекса иммунологических тестов не обнаружено противотуберкулезных антител. Титр антигена в сыворотке при постановке реакции агрегатагглютинации с эритроцитами, обработанными иммунной сывороткой против микобактерий туберкулеза, 1:8 (ниже диагностического титра реакции 1:32) .

У больного, не обнаружено антигенов физиологическим раствором от ГЛА смешивают с 1 мл агрегированной сыворотки, внося навеску бикарбоната натрия до 24-ной конечной концентрации. Смесь инкубируют 90 мин при

56 С после чего сенсибилизированные эритроциты отмывают трижды физиологическим раствором, ресуспендируют в 10 мл физиологического раствора, добавляют мертиолат 1:10000 и хранят при 4 С до использования. Поо становку реакции агрегатагглютина" ции проводят в агглютинационных

15 дисках микротитратора "Такачи" на

0,24-ной нормальной кроличьей сыворот.ке. Ее результаты учитывают после

1123 128 стрепто-, стафило- и пневмококка.

Произведена диссоциация иммунных комплексов в сыворотке. К 1 мл испы ° òóåìoé сыворотки крови добавляют

° 1 мл О,? И глицин-НС1-буфера рН 2,4 и инкубируют 30 мин при 37ОС для разрушения иммунных комплексов. Дальнейшее разделение разрушенных иммунных комплексов проводят на колонке 250х10 мм с сефадексом Г-200.

Для этого сыворотку с. глицин-НС1-буфером после инкубации (1:1) наслаивают на колонку и уравновешивают тем же буфером. После того как испытуемая сыворотка прошла через колонку, ее элюируют этим же глицин-НС1-буфером в количестве 12 образцов (фракций), каждая объемом 1 мл. Таким образом, из 1 мл испытуемой цельной сыворотки получают 12 фракций.

Для определения содержания в каждой фракции бактериального белка в

PAI необходимо нейтрализовать их бикарбонатом натрия до нейтрального рН.

Затем определяют конечный титр реак" ции на бактериальный белок в каждой из 12 фракций испытуемой сыворотки. Складывают показатели в каждой фракции и получают суммарный титр содержания антигена яо .всем фракциям (пробиркам) .

Поскольку вначале сыворотку разводят в два раза глицин-НС1-буфером, суммарный титр удваивают и получают таким образом окончательный ответ о содержании бактериального антигена в сыворотке больного путем разрушения специфических циркулирующих иммунных комплексов.

Постановку реакции агрегатагглюВ тинации проводят в агглютинационных

I досках микротитратора "Такачи" на

0,23-ной кроличьей сыворотке. Фракции разводят 1;4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 и т.д, Далее к ним добавляет обработанные глютаровым альдегидом и специфической иммунной сывороткой против разрушенных микобактерий ВСЖ (титр сыворотки в реакции преципитации 1:16} эритроциты и инкубируют в течение ) ч при 37 С, после чего учитывают результат реакции.

Титр антигена при постановке реакции агрегатагглютинации с иммунной сывороткой против микобактерий ту беркулеза после диссоциации иммунных комплексов у больного повысился до 1:128, антигены стрепто-, ста50 циации ЦИК титр стафилококкового антигена увеличился в четыре разе (1:64), а титр пневмококкового ан- тигена был 1:16, ниже диагностического титра для антигенов из ЦИК (1:32). Это дало возможность сделать заключение о ведущей роли в данном обострении патогенного стафилококка, а. пневмококк в настоящий момент не участвовал как этиологи5

45 фило- и пневмококков у него по-прежнему не обнаруживались. В дальнейшем при обследовании и по результатам лечения диагноз туберкулеза у данного больного был подтвержден.

Таким образом, в данном случае путем диссоциации иммунных комплексов у больного в сыворотке обнаружены антигены микобактерий-, что является прямым указанием на инфицирование микобактериями туберкулеза. Следовательно, уже в период поступления в стационар, когда диагноз туберкулеза был неясен, было получено указание на этнологию заболевания.

° Пример 2. Больная Б. поступила в диагностическое отделение с диагнозом: обострение простого (катарального) бронхита, а больной Д. - с диагнозом: обострение хронического обструктивного бронхита. При обследовании мокроты у больной,Б. был выделен пневмококк, а у больного Д. посев оказался стерильным. При первом иммунологическом обследовании не было выявлено никаких антител в обоих случаях. Методом про тотипа - РАà — у больного Б. были зарегистрированы свободные антигены патогенного стафилококка и пнев-. мококка в титрах 1:18 . При диссоциации ЦИК титры этих антигенов возросли соответственно 1:96 (в 6 раз) и 1:144 (в 9 раз). Это дало основаwe предположить, что к пневмококку в процессе обострения присоединился патогенный стафилококк. После прове.денной антибактериальной терапии на-. ступила ремиссия болезни с полной ликвидацией антигенов стафилококка и пневмококка иа крови как свободных, так и из ЦИК.

У больного Д. при обострении обструктивного бронхита были также об-. наружены свободные антигены патогенного стафилококка и пневмококка в крови в титрах 1:16 и 1: 8, причем слабо выражен последний. При диссо7 11231 ческий фактор, так как имелись лишь его следы в крови ° В результате проведенной антибактериальной терапии в стадии ремиссии у данного больного свободные антигены отсут5 ствовали, а антигены стафилококка из ЦИК были зарегистрированы в титре 1:32 (диагностический титр), антигены пневмококка как и прежде в титре 1:16 отсутствуют.

Необходимо отметить, что если при ремиссии простого бронхита антигены сразу же исчезают из крови, то в стадии ремиссии обструктивного бронхита антигены в ЦИК могут определяться длительно, до 4-6 месяцев, указывая на этиологический фактор данного заболевания.

Необходима указать и на прогностическое значение определения антигенов из ЦИК, особенно s процессе лечения, при длительных, хронически текущих заболеваниях легких. Наблю- 25 далась, например, группа больных фиброзно-кавернозным туберкулезом в Фазе распада, впервые выявленного.

При активном лечении свободные анти" гены из крови, как правило, исчезают. g0

У больных с плохой клиника-рентгенологической динамикой или со стабилизацией туберкулезного процесса антигены из ЦИК есть всегда и в больших титрах, часто при отсутствии свободных антигенов. В то же время в ,группе больных с хорошей клинико:рентгенологической динамикой при полном заживлении каверны происходит полная элиминация туберкулезных антигенов иэ крови.

В ЦНИИ туберкулеза Минздрава СССР обследованы больные туберкулезом, главным образом инфильтративным с 4 распадом и фиброзно-кавернознь1м в ста дии обострения (53 чел.), хроническими пневмониями и бронхитами (бб чел. ) .

Результаты исследований представлены в табл.5. . 50

В результате диссоциации иммунных комплексов у 48 человек (из 53 обследованных больных туберкулезом) выявлены туберкулезные антигены в титре выше установленного нами на здоровых лицах диагностического титра (1:32).

У 23 человек, у которых обнаруживались и свободно циркулирующие тубер28 8 кулезные антигены в крови, титры воз- росли в 14-2? раза (у 25 больных до диссоциации антигены в крови вовсе не выявлялись). В среднем чувствительность метода возросла в 10 раз.

У больных хроническими пневмониями

-и бронхитами также в 10 раз возросла чувствительность реакции при определении пневмококковых антигенов (при диагностическом титре 1:25), почти в 9 раз - при определении антигенов гемолитического стрептококка (диагностический титр 1:32), в 7 раз при определении антигенов патогенного стафилококка (при диагностическом титре 1:32). !

Таким образом, преимущество предлагаемого способа заключается в определении антигенов микобактерий туберкулеза в сыворотках больных, в которых они не определялись. Число таких больных возросло в зависимогти от формы болезни в 1,7-3,2 раза, в увеличении титров бактериальных антигенов, чта повысило чувствительность реакции по сравнению с прототипом в 7-19 раз; проведение эффективной противотуберкулезной или антибактериальной терапии в ряде случаев снижало титры антигенов в ЦИК, а при полном обратном развитии туберкулезного процесса или ремиссии хро- нических заболеваний легких (XHMI) они вообще не определялись. Это свидетельствует о прогностическом значении определения антигенов из ЦИК, обнаружение из ЦИК антигенов пневмококка, стафилококка или гемолитического стрептококка при хронических заболеваниях легких позволило более точно определить этиологический фактор заболевания, являющийся непосредственным возбудителем заболевания или обострения ХНЗП самостоятельно или в ассоциации с другими микробами.

Следовательно, определение бактериальных антигенов из ЦИК повышает эффективность диагностики всопалительных заболеваний легких, которая заключается в уточнении диагноза заболевания, особенно в тех случаях, когда показатели других иммунологических тестов находятся в пределах нормы.

1123128

Таблица 3

Таблица 1

Получение микоба ктериальных антигенов в титрах при изменении рН глицин-НС1-буфера 0,2 М в сыворотке больного туберкулезом М

Выход микобактериальных антигенов при.изменении температуры контакта сыворотки больного с глицин- HC 1-буфером

Титры полученного антигена

Антигены в титрах рН!

О Температура контакта в градусах

Табли ца 2

Получение ми коба кт ериал ьных антигенов в титрах при изменении ионной сил ы гли ци í-НС 1-буфера при рН 2,0 контакта и размеров частиц сефадекса и числа проб в элюате в сыворотке больного туберкулезом М

Таблица,4, Выход микобатериальных антигенов в титрах при изменении времени контакта сыворотки больного с глицин-HCl-буфером при с 37 С

Изменение какого-либо ,условия получения антигенов при сохранении всех остальных параметров

Титр антигена

Время контакта, мин

Титры антигенов

Ионная сила буФера

Размер частиц сефадекса

Число .проб элюата

12

I 45

Таблица 5

Содержание антигенов микробов в свободном виде и в циркулирующих иммунных комплексах у больных туберкулезом, пневмониями и бронхитами

Антигены.Показатели

Средняя геометрическая титра (N+m) Средний титр

Доверительный интервал (s 1g и титрах) 1:7,64 0,883+0,08

0,643-1, 12 титры 1:41:13,2, Туберкулез М

Свободные в крови

-3,0

2,8

2,4

2,0

1,8

l,4

1:60

1:80

l: l 40

1: t70

1:120

1:104

0,2 М

018

0,05 М

С-200

С-100 с-50

1:170

1:30

1:170

1:120

1:60

1:130

1:170

1:170

24

28

32

34

36

37

38

24

26

28

32

1:100

1:100

1:100

1: 110

1: 110

1: 120

l-.130

1-170

l: 140

1:100

1-30

1:62

1:84

1:90

1:120

1:170

1:136

l: 100

1123128

12

Продолжение табл.5

ЕФВЮ\ «ЮЮЕЕ

Средний титр

° В ФФ ФФ ФВ ВФ» ФВ ФВ «Ф

Ю Ю Ю Ф Е ФВ Ю Ю Е,Е Юе Ю О«ВОЮ Ю ЕЮ Ю Юе Ю О» Ю Ю

° Ф ВЮЮЮЮ

° Ве ВЮЮЮЕЮЮ

Антигеню

Показатели

Средняя геометрическая титра (Hgm) Доверительный интервал .(в lg и титрах)

° Ф Ю Ю Ю ФФ Ю ФВ Ю и Ю Е ФВ ФВ ОЮ Ю

° ° ЮЮ ЮЮЮЮЮ ЮЮФ

ЮЮ«Ю»ЮЕЕ ВЕ»

В иммунных комплексах

1,62-2, 08 титры 1:41,61:.2,02

0,072Л. 19 0т,.13-1 Л7 титры 1:1,35"

1: 18,6

1,:39-1,99 титры 1:24,81:97,7

0,900,19 . 0,33-1,47 . Титры 1:2,14"

1:29,5

1 53-2,01 титры 1:33 9"

1: 102,3

0, a03q0,266 0,03-1 63 титры 1 .1-1:6

1; 70,7 1,85+0 077

1 . 5,04

Свободные в крови

Йневмококк

1:49,4 . 1,ф9+0,1

В иммунных комплексах

Свободные в . 1:8 крови

Патогенный стафилококк

1. .58,4 1,77@0:,68

В иммунных комплексах

1»6

Свободные в крови

Гемолитический стрептококк

1:52,8

В иммунных комплексах

1,72+0, 14

1930-291 титры 1:20"

1: 138

0,.51-0,69 титры 1;3,21:4,9

0:,66" 1,04 титры 1:4,61 25

0,Q0,0Ç

Свободные в . 3:4 крови

Здоровые лица

0,90+0,08

f å.8

В иммунных комплексах

»ЕЕ»»» ЕЮ»»ЕЮ»ЕЕ«в» ФВЕЕФ ВЕЕФ ЕЕЕ ЕЮ ЕЕ»ЕЕ»»В

Техрел А,.Kðàâ÷óê Корректор С.йекмар

Редактор 0«Филиппова

Заказ .792 : Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб.,:д. 4/5: е

Ф

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул.Гагарина, 191