Способ получения салмонеллезного эритроцитарного диагностикума

 

Способ получения салмонеллезного эритроцитарного диагностикума путем формалинизации эритроцитов баранов и последующей их сенсибилизации полисахаридно-полипептидной фракцией Salmonella gallinarum-pullorum, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности диагностикума и возможности выявления носителества S.gullinarum-pullorum, S.typhimurium, S.enteritidis у птиц в полевых условиях, сенсибилизацию осуществляют в процессе формалинизации в смеси с О-антигенной фракцией Salmonella typlimurium, причем сенсибилизацию проводят при концентрации 1,8 - 2,1 мг сухого вещества каждой фракции на 0,9 - 1,0 мл 19 - 20%-ной взвеси эритроцитов на фосфатно-буферном растворе, содержащем 0,3 - 0,33% формальдегида, при 40 - 41^oС в течение 14 -16 ч.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения диагностических препаратов, используемых для массовой прижизненной диагностики сальмонеллезов птиц. Сальмонеллезы птиц, вызываемые S.gallinarum-pullorum, S.typhimurium, S. enteritidis, являются наиболее широко распространенными бактериальными болезнями домашних птиц, причиняющими большой экономический ущерб промышленному птицеводству страны. Известны способы получения сальмонеллезного эритроцитарного диагностикума, включающие выделение антигенной фракции из микробных клеток S.gallinarum-pullorum или S.typhimurium в виде деградированного или недеградированного полисахарида, липополисахаридного или полисахаридно-полипепетидного комплекса, 0-антигенной фракции, с последующей сенсибилизацией ею формалинизированных эритроцитов [1,2] Однако диагностические препараты, полученные известными способами, предназначены для выявления птиц, инфицированных соответствующим гомологичным антигену видом сальмонелл, т.к. они по своей сути являются специфическими монодиагностикумами. Поэтому, чтобы выявить три инфекции сальмонеллезной этиологии, необходимо птицу исследовать каждым диагностикумом отдельно, т.е. проверить все поголовье три раза. В случае неблагополучия хозяйства такие исследования должны проводить ежемесячно до получения двукратных отрицательных результатов исследования по всему поголовью птиц. Другим значительным недостатком монодиагностикумов является то, что при многократном исследовании птица подвергается сильным стрессам, обусловленным голодной диетой перед исследованием и нарушением привычного режима дня, что снижает продуктивность на 5-6 яиц в год на каждую несушку. Кроме того, чтобы удовлетворить потребность птицеводства страны в эритроцитарных монодиагностикумах, необходимо большое количество эритроцитов барана, поэтому биопредприятия вынуждены постоянно содержать 5 7 тыс. голов баранов-доноров. Целью изобретения является разработка способа получения принципиально нового высокочувствительного и специфичного антигена, пригодного для исследования всех видов домашних птиц одновременно на носительство S.gallinarum-pullorum, S.typhimurium, S.enteritidis в полевых условиях, и снижение затрат труда при исследовании птиц. Поставленная цель достигается в способе получения сальмонеллезного эритроцитарного диагностикума, включающем формалинизацию эритроцитов баранов и их последующую сенсибилизацию полисахаридно-полипептидной фракцией Salmonella gallinarum-pullorum, тем, что сенсибилизацию осуществляют в процессе формалинизации в смеси с 0-антигенной фракцией Salmonella typhimurium, причем сенсибилизацию проводят при концентрации 1,8 2,1 мг сухого вещества каждой фракции на 0,9 1,0 мл 19 20% взвеси эритроцитов баранов на фосфатно-буферном растворе, содержащем 0,3 0,33% формальдегида, при 40 - 41^oC в течение 14 16 ч. П р и м е р 1. А. Получение полисахаридно-полипептидной фракции S.gallinarum-pullorum. Бактериальную массу S.gallinarum-pullorum, выращенную на обычной питательной среде, осаждают центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 25 мин, отмывают от компонентов среды физиологическим раствором при том же режиме центрифугирования. Осадок отмытой бактериальной массы суспендируют в 0,2 н. растворе ледяной уксусной кислоты до концентрации 90 100 млрд микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности и экстрагируют при 92^oC в течение 60 мин. Гидролизат освобождают от бактериальных клеток центрифугированием при 6 тыс.об/мин в течение 40 мин, доводят рН гидролизата до 4,5 5,0 10% раствором КОН или NaOH. Полисахаридно-полипептидную фракцию осаждают из гидролизата 8 10 объемами этанола, отделяют центрифугированием при 4 тыс. об/мин в течение 20 мин, растворяют в дистиллированной воде (рН 8,5 9,0) из расчета 6 г сухого вещества на 1 л воды и выдерживают в водяной бане при 90^oC в течение 30 мин. Содержание общего, остаточного и белкового азота в растворе полисахаридно-полипептидной фракции определяют по Къельдалю, а редуцирующих веществ по Хагедорину-Йенсену. Количество указанных ингредиентов в 0,6% растворе фракции должно быть, мг редуцирующих веществ в пересчете на глюкозу 90 100, общего азота 35 40, остаточного азота 20 25, белкового азота 10 12. Б. Получение 0-антигенной фракции S.typhimurium. Бактериальную массу S. typhimurium, выращенную на обычной питательной среде, осаждают центрифугированием при 5 тыс.об/мин в течение 25 мин, отмывают физиологическим раствором от компонентов питательной среды при том же режиме центрифугирования, суспендируют в дистиллированной воде до концентрации 90 100 млрд микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности и экстрагируют при 95^oС в течение 2 ч. Экстракт освобождают от бактериальных клеток центрифугированием при 6 тыс.об/мин в течение 40 мин. 0-антигенную фракцию осаждают из экстракта 6-ю объемами этанола, отделяют центрифугированием при 4 тыс.об/мин в течение 20 мин, растворяют в дистиллированной воде (рН 7,6- 8,0) из расчета 6 г сухого вещества на 1 л воды и стерилизуют в водяной бане при 90^oC в течение 30 мин. В. Сенсибилизация и формалинизация эритроцитов барана. 2 л крови барана в равном объеме раствора Олсевера центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин, осадок эритроцитов 3 раза отмывают 5-ю объемами фосфатно-буферного раствора (рН 7,2 7,4) при том же режиме центрифугирования и суспендируют до 20% концентрации в фосфатно-буферном растворе. На 1 л 20% взвеси эритроцитов на фосфатно-буферном растворе добавляют по 300 мл 0,6% раствора полисахаридно-полипептидной фракции S.gallinarum-pullorum и 0-антигенной фракции S.typhimurium, формальдегид из расчета 0,3% тщательно перемешивают и взвесь эритроцитов выдерживают при 40^oC в течение 16 ч. По истечении срока сенсибилизации и формалинизации эритроциты осаждают центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин, отмывают 3 раза 5-ю объемами фосфатно-буферного раствора. Осадок отмытых сенсибилизированных и формалинизированных эритроцитов суспендируют в фосфатно-буферном растворе до 10% концентрации, добавляют формальдегид из расчета 0,03% Поливалентный антиген, приготовленный предлагаемым способом, сохраняет активность и специфичность в течение 9 мес. при +4 ^oC +8^oC. При таком способе получают высокочувствительный, специфичный поливалентный антиген, состоящий из полисахаридно-полипептидной фракции S.gallinarum-pullorum и 0-антигенной фракции S.typhimurium, обладающий высокой гемосенситивной, антителосвязывающей и агглютинирующей активностью, суммарная антигенная формула которого включает все 0-антигенные рецепторы, присущие S. gallinarum-pullorum, S. typhimurium, S.enteritidis, выявляет птиц, инфицированных любым из перечисленных видов сальмонелл в любом возрасте, и по всей диагностической ценности в кровекапельной реакции непрямой гемагглютинации не только не уступает, но и превосходит существующие монодиагностикумы (см. табл. 1 13). Сенсибилизация эритроцитов полисахаридно-полипептидной и 0-антигенной фракции одновременно с формализацией позволяет максимально снизить эффект конкуренции сенситинов, повысить степень насыщения рецепторов эритроцитов сенситинами, устраняет феномен теней и рыхлого связывания сенситинов. Кроме того, технология промышленного производства поливалентного антигена более надежна, проста и на 48 ч требует меньше времени, чем при изготовлении любого монодиагностикума, а также в 2-3 раза сокращает расход сенситинов и эритроцитов барана. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4 ТТТ5 ТТТ6 ТТТ7 ТТТ8 ТТТ9 ТТТ10 ТТТ11 ТТТ12 ТТТ13 ТТТ14

Формула изобретения

Способ получения салмонеллезного эритроцитарного диагностикума путем формалинизации эритроцитов баранов и последующей их сенсибилизации полисахаридно-полипептидной фракцией Salmonella gallinarum-pullorum, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности диагностикума и возможности выявления носителества S.gallinarum-pullorum, S.typhimurium, S.enteritidis у птиц в полевых условиях, сенсибилизацию осуществляют в процессе формалинизации в смеси с О-антигенной фракцией Salmonella typhimurium, причем сенсибилизацию проводят при концентрации 1,8 2,1 мг сухого вещества каждой фракции на 0,9 1,0 мл 19 20%-ной взвеси эритроцитов на фосфатно-буферном растворе, содержащем 0,3 0,33% формальдегида, при 40 - 41^oС в течение 14 -16 ч.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15