Способ определения состояния иммунореактивности

 

СПОСОБ ОП1П-ДЬ:Л1:НИЯ СОСТОЯНИЯ ИММУООРР, АКТИВНОСТИ иутем иоетановки реакции розеткообразова1И1я .лимфоцитов е (ритроцитами бараиа в ирисутетвии стимулятора, отличающийся Tt-M, что, с цел1)К) иовьпнеиия точности ои|)едоле1И1я , одновременно осуществ.пиот реакцию розеткообразования в нрисутствии .1азм1):.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК з(59 А 61 K 3(.)100

М)

0Э 3

CO

С (Р (2! ) 3549583<28-13 (22) 07.02.83 (46 ) 15. 1 1.84. Ь к>г!. ¹ 42 (72) Н. И. Лисяный, И. А. Г1риходченко, Л. И. Примушко, Т. А. Лисяная и В. Н. Руденко (/ ) KII»Â»K!1è на3 чно-)I»», 1(. L<)13!IT(,1(>»KIIII институт нсиро ирургии (53) 6 5.373 (088.8) (б6 ) 1 . Jl H Il()H А. С.>. k< > 31(1.1»K(. Il I>I I I н !!. Ill 3

Т ill)<1(!)()II!IT()I3 В м(. (т(p<) 3(TK<)(>()p!IH()13(l Ill! H.

«Лаборат<>рно» I».I<>», !!)80, Л 1, с. 36- -39.

2. »1»р».1((в А. 1!. 11т<>гll н!1 ки и т» ники, М., «Иммун<>.и !з!>! I. 4. 1!)74.

„„SU„„1123703 A (54) (57) С.11СКС)Ь С)11Р(.ЛГ.Л1.11ИЯ С:0С.ТОЯ Н И Я Г!ММУ11С) 1 1. А)СТИВ!!С)С:ТИ

IIEET(м п(>стан<)вки р»(!кции розстко<>бриз<)вниия зим(роцитов с зритр(>интами барана в llpll» тствии стимулятора, от.!и«аюи4!

T(м, IT(), с и»лыс> п<>выш llllH точки>сти (»(р». (»1 < 11 и Н, од н <> В p(м (н l I о о(l 11 ((. (. т в, я !от р (а K!

ill l<) роз»TK()()6(>;33<)13d II Il H В и р и »3 T T 131111 а ут<и!.з !)з м ы.

1123703

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и может быть использовано для определения иммунологических состояний организма.

Известен способ определения иммунореактивности лимфоцитов к действию лимфоцитактивных веществ in vitro (левамизола, спленина, зимозана, тимозина и др.) (1).

Однако известный способ недостаточно точен, поскольку исключает участие гуморальных факторов в иммунном ответе.

Цель изобретения — повышение точности определения состояния иммуннореактивности.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения состояния иммуннореактивности путем постановки реакции розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами барана в присутствии стимулятора, одновременно осуществляют реакцию розеткообразования в присутствии 20 аутоплазмы.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделение лимфоцитов проводится в стандартных условиях способа (2).

Кровь больных собирают в пробирки, куда предварительно был внесен гепарин (25 ед/мл крови) . Затем кровь разводят в соотношении 1:3 изотоническим буферным раствором, наслаивают на смесь фикола-гипак плотностью 1,077 г/мл и цент- 30 рифугируют в течение 30 мин при 20 при

400 . Собирают слой клеток с интерфазного слоя и 3 раза буферным раствором.

Определяют количество клеток и дово6 дят суспензию до концентрации 2,10 /мл клеток.

Далее в три конические пробирки вносят по 0,1 мл взвеси лимфоцитов и затем в 1 пробирку вносится 0,1 мл левамизола в концентрации 10 мг и 0,1 мл среды, во 40 вторую пробирку — 0,1 мл левамизола и

0,1 мл пазмы крови, в третью пробирку—

0,2 мл среды. Все три пробирки помещают в термостат и инкубируют при 37 в течение

60 мин. Затем пробы один раз центрифугируют при 150 р 5 мин и взвешивают осадки клеток в объеме О,1 мл. Во все три пробы вносят эритроциты объемом 0,1 мл 0,50/o-ной взвеси. Далее пробирки центрифугируют

5 мин при 150g инкубируют 5 мин при 37 в термостате и затем 60 мин при 4, 3атем ресуспензируют и добавляют 0,05 мл

30/р-ного глютаральдегида и через 20 мин

2,0 мл Н,О. Центрифугируют, осадок клеток взвешивают в объеме 0,1 мл и наносят на стекло по каплям. После высыхания капель клетки фиксируют метанолом и окрашивают. Подсчитывают процент розеткообразующих клеток в каждой пробе под микроскопом.

Пример 1. Больная Г. Оперирована по поводу внутримозговой злокачественной опухоли. Спустя 10 дней взята кровь для исследования. Определение состояния реактивности указанным способом показало, что в первой пробе процент E-РОК равен

60, во второй с левамизолом — 670/>, в третьей с левамизолом и плазмой — 54 /О, Следовательно, у больной имеется относительно чувствительное к иммунной стимуляции состояние иммунной системы, так как в плазме присутствует блокирующий фактор, который снимает эффект стимуляции.

Пример 2. Больной Ш. Поступил в клинику института с диагнозом: опухоль правой затылочной теменной области. Исследование состояния иммунореактивности до операции показало, что в пробе 1 (контрольной) процент E-РОК равен 35, а пробе 2 с левамизолом — 41 /О, а в пробе 3 с левамизолом и плазмой — - 23 /o. Следовательно, у больного в крови имеется блокирующий фактор, снимающий эффект иммуностимуляции in vitro. Состояние иммунореактивности можно оценить как относительно чувствительное к иммуностимуляции.

Пример 3. Больная М. Поступила в клинику с диагнозом: опухоль правой лобно. теменной области (глиобластома) . Исследование состояния иммунореактивности показало; в пробе I — процент E-РОК равен

47, в пробе 2 с лева мизолом — — 48 /р, Е-РОК в пробе 3 с левамизолом и плазмой — 560/o.

Следовательно, стимулирующий эффект левамизола проявляется только в присутствии плазмы крови. Состояние иммунореактивности можно оценить как чувствительное к стимуляции.

Разграничение состояний иммунореакTHBIjocTH (нечувствител ьное, чувствительное или относительно чувствительное) основано на различии показаний трех реакций. Количественные показатели этих реакций, на основании которых делается заключение о состоянии иммунореактивности, зависят от воспроизводимости (надежности или точности) способа.

Учитывая многолетний опыт работы с этой реакцией, а также разноречивый характер данных об уровне E-РОК в крови от

35% до 80 /o Е-РОК у практически здоровых людей в зависимости от способа постановки можно сделать вывод, что разница в показаниях 3 — 5 /О не существенная, не достоверная, Различие свыше 6 /o — достоверное различие в показателях проб. Отсюда: рефрактерное (нечувствительное) состояние, когда в пробах с иммуноактивным веществом процент розеткообразования такой, как в контроле без препарата или

1123703 на 3 — 5 /о выше или ниже; чувствительное состояние, когда в обеих пробах с лимфоактивным веществом количество Е-РОК выше или ниже на 6 / и более, чем в контрольной пробе без препарата; относительно чувствительное состояние, когда в пробе с лимфоактивным веществом и плазмой количество EРОК ниже на 6 / и более, чем в пробе без плазмы.

Способ апробирован на 32 больных с черепно-мозговой травмой. При использовании известного и предлагаемого способов получены следующие результаты, представленные в таблице 1.

Таким образом, применение двух способов диагностики на одних и тех же боль-15 ных с черепно-мозговой травмой позволяет их сравнить и оценить. Предлагаемый способ диагностики выявляет группу относительно чувствительных к иммуностимуляции больных, у которых имеются блокирующие плазменные факторы, способные ниве- 20 лировать эффект стимуляции.

Эта группа относительно чувствительных составляет в данном случае около 40 /< от всех чувствительных к стимуляции. Тогда как у 60 /о больных с черепно-мозговой травмой лимфоциты крови стимулируются левамизолом. Но почти у головины из них в плазме имеется блокирующий фактор, который снимает эффект стимуляции.

Подобные данные получены и с другими иммуностимуляторами. В подтверждение зО этого приводится табл. 2, где лимфоциты здоровых лиц (доноры крови) инкубировались совместно с левамизолом, тимозином, спленином, зимозаном в присутствии аутоплазмы или без нее. Как видно из табл. 2 у 4-го и 5-го доноров снижен уровень ТРОК (синоним Т-лимфоцитов) — 28 /р и

29 /<> соответственно. Следовательно, эти два донора могут рассматриваться как условно здоровые лица, так как у них имеется дефицит количества Т-лимфоцитов в 4 ) крови. При воздействии левамизола в присутствии аутоплазмы отмечено, что он практически не влияет на уровень Т-РОК клеток у первых трех доноров (колебания в пределах воспроизводимости способа) . Тогда как у 4-го и 5-го доноров наблюдается увеличение розеткообразования íà 10 и более процентов. Аутоплазма ни в одном из примеров не влияет на стимуляцию левам изолом.

При воздействии спленина на лимфоциты доноров наблюдается другая картина, а именно спленин сам по себе без плазмы вызывает угнетение РОК, особенно выраженное у 3-го донора, и усиливает Т- розеткообразование у 4-го и 5-го доноров. В то же время при действии аутоплазмы крови угнетающее действие спленина снижается у 1-го и 3-го донора и не проявляется у

4-го и 5-ro донора. Следовательно, спленин оказывает HMM) Hoìoäóëèðóþùåå воздействие на лимфоциты и аутоплазма снимает или,усиливает действие спленина. Зимозан также оказывает неоднозначное действие на Е-РОК, и аутоплазма, в свою очередь, коррелирует эффект зимозана. Например зимозан у первого донора усиливает E-РОК, а у второго и третьего угнетает. Плазма в присутствии зимозана усиливает E-РОК у первого и четвертого доноров и не влияет на E-РОК у третьего. Тимозпн оказывает иммуномодулируюшее действие на

E-РОК лимфоцитов, особенно в присутствии плазмы крови, у лиц с низким содержанием

Е-РОК происходит увеличение, а у лиц с нормальными значениями нет эффекта.

Таким образом, оценка состояния иммунореактивности у пяти доноров с помощью четырех иммуностимуляторов показывает, что предлагаемый способ оценки применим не только к левамизолу, но и к другим препаратам.

Таким образом, предлагаемый способ определения состояния иммунореактивности значительно повышает точность и объективность за счет включения в реакцию in ч1(го плазмы крови, тем самым значительно расширяется представление о причинах сниженной реактивности и отсутствия эффекта иммуностимулирующих лекарств в организме, тогда как известный способ не позволяет выявлять все формы сниженной иммунореактивности.

1123703 о Е о х

Ю Х

Р» съ о

1-с X х сч со сч Q

» »т т с Ъ

1 Х о о

1- X съ

v Е о ьс ю х съ съ о н х х

I»

«:(Е

Щ W

ttt

ttl а ъ хо сч - о о о

° » с Ъ с Ъ СЧ х о

Q, о х о с»

v X с

hc x

Ю х съ о

1-с X х ф» х

1 о о

Е х 5 х о

Р, с

Ю 0 СЪ СЪ

ЦЪ Ъ СЪ СЪ СЪ сх о х

Ф х х

Р.

tU в х а

Cl х

1 с! с! Ю

Е ссЪ

Itt сс а х х

ttI Х и Е о х

Ю ttt !

Ъ, съ

l 0

X х сч х

Л С Ъ CO ЧЪ СЧ ф с"ъ сч съ о

v Е о ь4 х ю х н м v о е

X х

Ц

1

Е а

t ъ !

v о и

5 и

Р

1 Х о о

X съ

О СЧ Ю сЪ С! ю съ с-ъ

1 х

М tt!

Ю Р

1-ч о сч о х х х с!

Ц

Э

ttt Ю с! ъ о х ° х O.

О сч со с сч

СЧ С Ъ С 1 х

М

Ю m х

1 С! н

I >Х о о ! X

ttI ttl х Б мъ л о со т t .Ф с Ъ

I м

Р» Ш ! Э н сч v х X

Ъ о Йю ц х

oom ХсЧ о со л л т с ъ с»\ с»\

E о ы хо

v o

1 мн о со — m o

» т сч сч

Р Р Р Р Р

О О О О О х х х х

О О О О О

k(сг с(с(с( x 1х сс их

З 1 1 I 1 гс съ ъ

Редактор И. Касарда

Заказ 8036/8

Составитель Г. Крюкова

Техред И. Верес Корректор М. Розман

Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

I 13035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород. ул. Проектная, 4