Способ связывания глобулярных белков с проционовыми красителями

 

СПОСОБ СВЯЗЫВАНИЯ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ С ПРОЦИОНОВЫМИ КРАСИТЕЛЯМИ путем инкубации водного раствора белка с красителем, отличающийся тем, что, с целью повышения прочности связывания, белок с красителем смешивают в молярном соотношении 1:35 - 1:45, доводят рН смеси до 2,0 - 2,5, после инкубации проводят обратимое осаждение белка, далее белок растворяют и последовательно инкубируют при рН 6,8-7,0, а затем при рН 9,0-11,0 до максимального связывания белка с красителем .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

NVNOIN

РЕСПУБЛИК

«вЗ0««

418 A

gpss С:О1 N 1/30

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

Л и НВЮ O

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

<< АВТО< <<<<МУ СВ<«<ВТЕ<<< СТВ<< (21) 3597400/28-13 (22) 25.05,83 (46) 15,11.84. Бюп.И 42 (72) А.В.Ткаченко (71) Институт биологической физи ки АН СССР (53) 612,857.2 (088.8) (56) I, Лихтенштеин Г.И., Пивоваров А.П., Смолина Н.Б. Изучение структурных переходЬв в сывороточных альбумипах методом люминисцентно. активных меток.-"Молекулярная биология", 1968, т.2, с.291-302. (54) (57) СПОСОБ СВЯЗЫВАНИЯ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ С ПРОЦИОНОВЫИИ КРАСИТЕЛЯМИ путем инкубации водного раствора белка с красителем, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения прочности связывания, белок с красителем смешивают в молярном соотношении 1:35 — 1:45, доводят рН смеси до 2,0 — 2,5, после инкубации проводят обратимое осалдение белка, далее белок растворяют и последовательно инкубируют при рН 6,8-7,0, а затеи лри рН 9 ° 0-11 0 до максимального связывания белка с красителем.

1 . 11241

Изобретение относится к способам химической модификации белковых молекул, а именно к способам окраски белков процноновыми красителями, и может быть использовано в биохимии, молекулярной биологии, клинико-экспериментальной медицине и биотехнологии.

Известен способ связывания глобулярных белков с проционовыми краси- tO телями путем инкубации водного раствора белка с красителем, заключающийся в том, что смесь окрашиваемого белка с проционовым красителем в водной среде инкубируют при перемешивании в условиях поддержания стабильной в течение всего процесса окрашивания активной кислотности в диапазоне рН 3,4-9,8 и при стабильной в течении всего процесса окрашивания температуре в диапазоне 1,5-41 С.

Инкубацию продолжают до 24 ч. Затем окрашенный белок выделяют от свободного красителя фильтрацией в колон. ке с сефадексом С вЂ” 25 или-С"50 (1).

Однако известный способ не обеспечивает прочного (ковалентного) свяэывания молекул красителя с молеку" лами белка.

Целью изобретения является повышение прочности связывания красителя с белком.

Укаэанная цель достигается тем, что согласно способу связывания глобулярных белков с проционовЫми красителями путем инкубации водного раствора белка с Красителем, белок с красителем смешивают в молярном соотношении 1:35-1:45, доводят рН смеси до 2,0-2,5, после инкубации проводят обратимое осаждение белка, далее белок растворяют и последовательно инкубируют .при рН 6,8-7,0, а затем при рН 9,0-!1,0 до максимального связывания белка с красителем. т

4S !

Пример . Окрашивание лактатдегидрогеназы (молекулярная масса

100000-135000, р I 4,5) проционовым красителем печатающим зеленым В. Навеску белка (20 мг) растворяют в 2 мп 0,15 М NaCl. Добавляют 4,8 мг красителя (молярное соотношение белок: краситель составляет 1:40).

Смесь тщательно перемешивают. Посредством О 2 н.HCl рН раствора доводят у 1

Ф до 2,3. Раствор инкубируют при 4 С в течение !5 мин. Дпя высаливания белка доводят рН посредством 0,5 í.NaOH

98 2 до 7,0 и добавляют при тщательном перемешивании 0,5 r сульфата аммония.

Высоленный белок, содержащий нековалентно связанный краситель, отделяют центрифугированием при 4000 об/мин, 20 мин, 4 С.Белковый осадок вновь растворяют в 2 мл 0,15 М NaC1 (рН 7,0), .Раствор диализируют против 500 мл 0,15 М NaC1 (рн 7,0), содержащих 150 мг исходного свободного красителя, в течение 2 ч для удаления остатков высаливающего агента. Для ковалентного свяэывания красителя диалиэованный раствор белка инкубируют при рН 6,9, добавив в раствор 40 мг трис-буфера и концентрированной НС1 (данное значение рН соответствует рК имидаэольных групп гистидиновых остатков в составе белка). Раствор инкубируют при 37 С в течение 4 ч, а затем - при комнатной температуре в течение 10 ч.

Для ковалентного связывания красителя по месту Н-концевых аминогрупп и аминогрупп лиэиновых остатков в составе белка в раствор добавляют еще 40 мг трис-буфера и несколько капель 0,2 н.НС1- до рН 10,0. Инкубируют этот раствор при комнатной температуре в течение 4 ч, а затем— при 7 С в течение 24 ч. Для очистки окрашенного белка от свободного красителя раствор фильтруют через сефадекс G — 75 (колонка 40 .1,0 см ), используя в качестве элюирующего растворителя 0,15 М NaCl(pH 1 0,0), и лиофилизируют. При троекратном воспроизведении данного опыта содержание ковалентного связанного красителя в бел-, ке составляло в среднем 12,8Х (в расчете на массу белка).

При спектрофотометрическом анализе растворов белков, окрашенных предлагаемым способом, в 0,15 М НаС1 (рн 7,0) максимум поглощения, света белковыми растворами оказывается сдвинутым в длинноволновую область в сравнении с максимумом поглощения света растворами соответствующих свободных красителей. При фильтрации окрашенных белков через сефадекс

G-100 или С-150 красители остаются . связанными с белками. Остаются связанными с белками красители при дискэлектрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, причем электрофоретическая подвижность окрашенных белков (например, подвижность окрашенного процио"

3 »241 å8 ном ярко-синим сывороточного альбуми на н его субфракций) практически не отличается от подвижности соответствующих неокрашенных белков, для выявления которых на фореграммах при- 5 меняли обычную фиксацию и .окраску кумасси ярко-синим G-250. При экстракции окрашенных предлагаемым способом белков диметилформамидом, этанолом или смесью пиридина, муравьиной кислоты и воды красителя остаются связанными с белками.

При осуществлении связывания проционовых красителей с сывороточным альбумином по известному способу (1 -15 путем инкубации смеси красителя и белка при рН 6,2 и температуре 20-4& в течение 1- 24 ч с последующей очисткой белка фильтрацией через сефадекс G-75, сывороточный альбумин пол- ® ностью освобождается от связанного красителя, например, при электрофоретическом фракционировании в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. 25

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить прочность связывания проционовых красителей с глобулярными белками, обеспечивая ковалентное связывание белков с красите- 30 лями.

Белки, связанные с проционовыми красителями по предлагаемому способу, могут быть использованы в клинической медицине для изучения ком1 партментализации и метаболизма белковых гидролизатов, вводимых в организм в составе препаратов для парен» терального питания, плаэмозамещающих и деэинтоксикационных растворов; оценки эффективности и надежности полупроницаемых мембран, используемых при гемодиалиэе; оценки эффективности лечебного электцофореза ферментов (электроэнзимотерапия); оценки проницаемости кишечной стенки по отношению к белкам и продуктам их гидролиза с оценкой роли экэогенных белков в жтиопатогенезе пищевой идиосинкразии; изучения реакций антителообраэования и рецепции антител; определения нротеолитической активности ферментов, проведения диагностического электрофореэа с количественной оценкой получаемых белковых фракций беэ какой-либо фиксации и окраски фореграмм; оценки стерильности помещений, оборудования, инструментов и препаратов нри использовании микроорганизмов, содержащих меченые красителем белки или продукты гидролиза окрашенных белков, а также могут быть использованы для решения ряда задач но исследованию свойств белков в экспериментальной медицине и биологии.

Составитель Н. Гуляева

Техред Д.Коцюбняк

Редактор М.Бандура

Корректор Г.Решетник

Подписное

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4

Заказ 8271/33 Тираж-822

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5