Способ получения инсулина

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА , включающий в себя инкубацию компонентов крови и последующее выделение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и активности инсулина, инкубации подвергают отмытые эритроциты крови человека, которые выдерживают в течение 90-120 мин в растворе, содержащем физиологический раствор и этанол при соотношении эритроциты-физиологический раствор и этанол 1:1:0,007- 0,014, затем эритроциты отделяют от супернатанта и выделение инсулина проводят путем гель-фильтрации ,супернатанта на сефадексе или осаждением с последующей кристаллизацией.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„, 1131507 А

3Ш А 61 К 37/26; А 61 К 35/14

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

Н А BTOPGKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА, включающий в себя инкубацию компонентов крови и последующее выделение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и активности инсулина, инкубации подвергают отмытые эритроциты крови человека, которые выдерживают в течение 90 — 120 мин в растворе, содержащем физиологический раствор и этанол при соотношении эритроциты-физиологический раствор и этанол 1:1:0,007—

0,014, затем эритроциты отделяют от супернатанта и выделение инсулина проводят путем гель-фильтрации супернатанта на сефадексе или осаждением с последующей кристаллизацией. (21) 3489970/28-13 (22) 28.05.82 (46) 30.12.84. Бюл. № 48 (72) С. А. Кузнецов и E. А. Халаим (71) Черновицкий ордена Трудового Красного Знамени государственный университет (53) 615.361 (088.8) (56) 1. Pettinga P. Jnsu1 in-Biochemical

Prepavasion Меъ - York-1ondon, 1958, ч. 6, р. 28 — 35.

2. Патент США № 4139611, кл. А 61 К 37/26, 1979.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, 1131507

Изобретение относится к биологии и медицине, и может быть использовано в практических целях для разработки способа промышленного получения наиболее эффективного для медицинских целей лечебного препарата инсулина человека; в научных целях для изучения механизмов интернализации, депонирования и транспорта инсулина эритроцитами; для диагностического выявления резервов гормона в . форменных элементах крови лиц, подозреваемых в возможном развитии диабета и других эндокринных расстройств; для изготовления человеческого стандарт-инсулина и стандартных инсулинов различных животных.

Известен способ получения как гормона инсулина, так и медицинского препарата из поджелудочной железы путем экстракции его подключенным 70 спиртом с последующей многоэтапной очисткой экстракта от примесей белков и липидов (!).

Однако известный способ не пригоден для получения инсулина человека. .Известен также способ получения инсулина из крови или компонентов крови теплокровных животных, при этом кровь или форменные элементы предварительно разбавляют 0,5 — 0,4 объемами гидрофильного разбавителя, доводят рН полученного раствора от 2 — 4 до 8 в 10 и инкубируют обработанную таким образом кровь при 15—

40 С по крайней мере несколько часов.

Далее кровь охлаждают до 10 С, диализуют после нейтрализации через мембрану, проницаемую для молекул с мол. мас. 6000 и из диализата выделяют органические пептидсодержащие вещества, имеющие мол. мас

350 †60 и инсулиноподобную активность

14 — 40 мкед/мг твердого вещества.

Практическое применение способа позволило получить в среднем из 100 л крови животных до 320 r Uцеeл еeв оoг о o tп р оoд )у кKтTа, активность которого равна 14 — 40 мкед/мг при определении ее по биологическому действию на выделенных адипоцитах (2).

Таким образом, техника извлечения по этому способу инсулина дает малый выход, сложна, трудоемка и продолжительна, требует при операциях изменения рН и температуры. После инкубации из смеси извлекается далеко не весь гармон, а только тысячная его часть. Форменные элементы и плазма крови после получения инсулина не могут быть использованы в гематологии и для научных целей.

Цель изобретения — повышение активности и выхода инсулина.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения инсулина, включающему в себя инкубацию компонентов крови и последующее выделение целевого продукта, инкубации подвергают отмытые эритроциты крови человека, которые выдер10

55 живают в течение 90 †1 мин в растворе, содержащем физиологический раствор и этанол при соотношении эритроциты — физиологический раствор и этанол 1:1:0,007—

0,014, затем эритроциты отделяют от супернатанта и выделение инсулина проводят путем гель-фильтрации супернатанта на сефадексе или осаждением с последующей кристаллизацией.

Способ осуществляют следующим образом.

Отделяют эритроциты от плазмы крови путем отстоя или центрифугирования. К эритроцитарной массе добавляют изотонический раствор хлористого натрия (9 г. на литр) в соотношении 1:10. Смесь перемешивают и центрифугируют при 2000 об в минуту . (g = 800) в течение 10 мин. Супернатант отбрасывают. Эритроцитарную массу промывают, таким образом, три раза.

После отмывания к эритроцитам добавляют изотонический раствор NaC1, содержащий этанол так, чтобы соотношение объемов эритроциты, физиологический раствор, этанол, составляло 1:1:0,007 — 0,014. Инкубацию полученной смеси проводят при 20 С и полиэтиленовой емкости. Время инкубации 90—

120 мин. Затем путем центрифугирования (g == 800; 10 мин) отделяют супернатант.

Эритроциты и отделенная вначале процесса плазма крови годны для дальнейшего использования в гематологии. Полученный супернатант подвергают биохимическому фракционированию для выделения инсулина.

Инсулин получают путем гель-фильтрации на колонке с сефадексом Г-5, высотой 80 см и диаметром 1,5 см. В качестве элюирующего раствора применяют дистиллированную воду. Скорость элюции для препаративных целей 0,3 мл/мин, для аналитических—

0,06 мл/мин. Собирают фракции 2,37 — 2.75

Ve/V, . Собранные фракции при необходимости дополнительно обессаливают на сеф а де к се Г- 10.

Полученный раствор инсулина можно подвергнуть дальнейшей очистке и получить кристаллический порошок, с этой целью осаждают аморфный цинкинсулин с добавлением 10О/р СНзСОО/2 Zn, доводя рН до 6,0 и осаждая гормон при 4 С в течение

24 ч. Осадок отделяют и растворяют в 0,1 н лимонной кислоте, добавляют 5О/o Zn Cl и ацетон, поддерживая рН 6,0. Процесс кристаллизации продолжают при 4 С в течение 46 ч, после чего отделяют выпавшие кристаллы гормона. Кроме того, оказалось возможным, применяя указанную методику, осадить инсулин и без предварительного отделения балластных белков на колонке, хотя в этом случае степень очистки гормона ниже и не образовывались кристаллы инсулина, выпавший .осадок содержит инсулин.

1131507

Составитель В. Брусиловская

Техред И. Верес Корректор И. Эрдейи

Тираж 687 I10äп и с нос

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Редактор М. Дылын

Заказ 9313/2

Применение этого способа позволяет избежать трудоемкой операции гель-фильтрации на сефадексе.

Пример I. 200 мл цельной донорской крови центрифугируют g = 800 в течение

10 мин. Отделяют плазму, крови. К оставшимся 96 мл эритроцитарной массы добавляют

960 мл изотонического раствора хлористого натрия (9 г NaCl на 1 л). Смесь центрифугируют при g = 800 в течение 10 мин. Супернатант отбрасывают. Эритроцитарную массу промывают таким образом три раза.

К оставшимся 90 мл эритроцитарной массы добавляют изотонический раствор хлористого натрия, содержащий этанол в концентрации 2,5% (2,34 мл) 90 мл. Инкубируют эритроциты при перемешивании 90 мин при 20 С. Отделяют супернатант центрифугированием g = 800 в течение 10 мин и проводят его биохимическое фракционирование путем гель-фильтрации на сефадексе Г-50, высота колонки 80 см, диаметр 1,5 см. В качестве элюирующего раствора применяют дистиллированную воду. Собирают фракции от 2,37 — 2,75 Ve/V . Скорость элюции

0,3 мл/мин. Собранные фракции подвергают обессаливанию на сефадексе Г-1О. Полученный раствор белка высушивают. Вес сухого порошка составлял 115 мг. Радиоиммунологическое определение активности полученного инсулина, проведенное с помощью набора ИРИ производства ВНР, выявило активность, равную 48 мед/мг.

Пример 2. 241 мл цельной крови отделяют от плазмы и отмывают физиологическим раствором аналогично примеру l. Оставшиеся 130 мл эритромассы инкубируют в 130 мл физиологического раствора, содержащего 2,5% этанола (13,04 мл 96 этанола), в течение 120 мин. при перемешивании. Отделяют супернатант. К 120 мл супернатанта добавляют 80 мл раствора, содержащего 20 г СНз (СОО), Zn, доводят рН до 6,0. Полученный осадок растворяют в 50 мл 0,1 н, лимонной кислоты, добавляют 0 мл раствора, содержащего 3 r

Zn0C1 и ацетона. Доводят рН до 6,0. Кристаллизируют гормон при 4 С в течение 48 ч.

Отделяют выпавший осадок гормона и высушивают на воздухе. Всего получено 137 мг сухого вещества с активностью ИРИ

39 мкед/мг.

Выделенный ° гормон подвергали радиоиммунологическому, иммунологическому и биологическому тестированию, проводили

ЗО

50 определенйя его электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле. В результате проведенного радиоиммунологического определения (ИРИ) и определения биологического эффекта выделенного продукта установлено, что выделенный белок является инсулином.

Применение различных способов очистки позволяет получить активность около

40 мкед/мг сухого вещества, что приблизительно в 000 раз выше, чем активность целевого продукта. получаемого по известному способу. Биологическое тестирование на белых мышах, основанное на свойстве введенного инсулина вызывать гипогликемические судороги и гибель животных, проведенное с гормоном, выделенным из эритроцитов, подтверждает наличие биологической активности целевого продукта. После инъекции выделенного белка мышам в дозе

3 мг на животное у всех мышей (}1 = 20) через 60 — 90 мин наблюдалось снижение концентрации глюкозы почти вдвое, гипогликемические судороги и на их фоне смерть. Введение на фоне судорог мышам (и = 10) 20 мг глюкозы прекращало судороги и предупреждало гибель животных.

Таким образом, способ позволяет использовать,locT) ïíoå сырье, в промышленных масштаба х получать человеческий гормон, получение которого другим путем невозможно. Получение человеческого гормона даст возможность создания лекарственного препарата, применсшн такого лекарства позволит изб< .+,ать широко раси ространенHblx ослож11< ний. присущих применяемым сейчас препаратам. Кроме того, возможно на базе предлагаемого способа изготовление стандартных инсулинов для радиоиммунологических наборов, для эндокринологических и биологических исследований.

Изготовление человеческого стандартчнсулина для таких наборов, применяемых в медицинских и научных учреждениях, позволит в год экономить до 30 000 р.

Разработка ни базе прсдлагаемого способа медицинского прсплр; т» инсулина и его применение .;аст общеэкономический эффект до 200(1}0 р. в год.

Применение чмчунологически присущего человеку гормона позволит избежать нежелательных осложнений.

Предлагаемый способ прост и экономичен, н< требует сложного оборудования, позволяет сохранить плазму и эритроциты крови для целей гематологии.