Способ разделения жидкости,содержащей вещества крови

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3(50 A 61

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО Д ОТКРЫТИ (21) 2427755/28-13 (22) 10.12.76 (31) 75.13987-3. (32) 11.12.75 (33) Швеция (46) 30.01.84. Бюл.9 4 (75). Пауль Йеран Сигвард Линдроос (Швеция) (53) 615.361.018.51/55(088.8) (56) 1. Putnam F.W., ed., The Plasma

Proteins 2th ed., vol.1, Acad.Press, NY 1975, р.158.

2. Розенберг Г,.Я., Андреева A.H. ,Тюрина Г.В., Левина A.A. Полякова A.Ñ. и Шлимак В, Y. Получение нативного гло-. бина и изучение его физико-химических.свойств. -"Проблемы гематол.перелив.крови", 1970, Р 9, с.54. (54 ) (57 ) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ ЖИДКОСТИ, СОДЕРЖАЩЕИ ВЕЩЕСТВА КРОВИ, путем охлаждения раствора гемоглобгча, до- .> бавления осадителя, фильтрации полученной смеси, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью упрощения процесса, раствор гемрглобина охлаждают до температуры +8- -20ОС, добавляют этанол до концентрации 40-70%, доводят рН до 2,5-4,5, добавляют неорганические соли натрия или калия, пульпу красных кровяных телец, выделившиеся агломераты отделяют от раствора глобина известным образом.

1071208

Изобретение относится к способам отделения из жидкости, содержащей вещества крови, производных гемоглобина — соединений железа от протеина, главным образом.глобина, который мо" жет. быть впоследствии использован или 5 в пищевой промышленности s связи с его питательной ценностью, или при сохранении его функциональных свойств в качестве структурного агента.

Известен лабораторный способ раз деления жидкостей, содержащих вещества крови (соединения железа и глобин) путем экстракции, при которой используют такие растворители, как метилэтилкетон, ацетон и диметилформ- 15 амид E1) °

Однако получаемый по укаэанному способу продукт непригоден для использования в качестве корма для скота или в качестве пищевого продукта.

Наиболее близким к предлагаемому является способ разделения жидкости, содержащей вещества крови путем охлаждения раствора гемоглобина, добавления осадителя, фильтрации полученной смеси С23. Однако известный способ достаточ- но сложен.

Цель изобретения - упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем,30 что при осуществлении способа разде ления жидкости, содержащей вещества: крови, путем охлаждения раствора гемоглобина, добавления осадителя, фильтрации полученной смеси, раствор re- 35 моглобина охлаждают до температуры

+8 — -20ОС, добавляют этанол до концентрации 40-70Ъ, доводят рН до 2,54,5, добавляют неорганические соли натрия или калия, пульпу красных кро 40 вяных телец, выделившиеся агломераты отделяют от раствора глобина известным образом.

Пример 1. Пульпу красных кровяных телец из крови с бойни вмес-45 те с цитратом натрия в качестве антикоагулирующего агента, обрабатывают этанолом и водой таким образом, чтобы вызвать разрыв клеточных мембран. Фрагменты. клеточных мембран удаляют центрифугированием. Получают 50 раствор гемоглобина, содержащий 15% сухого вещества, в основном гемоглобина, 33 об.Ъ этанола, остальное воду. Значение рН составляет 5,3, цвет темно-красный.

3 г этого раствора гемоглобина охлаждают до температуры -12 С в химическом стакане, и в раствор капают при непрерывном перемешивании и охлаждении раствор, состоящий из 60 . 0,5 мл 1М соляной кислоты и из 10 мл

96%-ного этанола при -12ОC. После добавления раствора температура со-, ставляет -12 С, а значение рН 3,1. Содержание этанола в смеси 78 об.Ъ.

Значение рН определяют таким образом, что образцы смеси разбавляют трехкратным объемом воды перед определением.

Смесь, имеющую черно-коричневый цвет, центрифугируют при 27000 и в течение 10 мин в центрифуге Сорвалла (Sorvaif) при температуре о

-12 С и получают черную пасту в количестве 1,5 г с содержанием сухих веществ 2,9%, и светло-коричневую жидкость поверхностного слоя. Из жидкости поверхностного слоя осаждают светло-серый осадок, добавляя воду до 50% и доведя значение рН до

7,5. Температуру поддерживают при о

"7 С. Осадок удаляют центрифугиро. ванием и получают серую пасту в количестве 0,95 r с содержанием сухих веществ 28%.

Из результатов следует, что серая паста состоит из протеина с содержанием железа примерно 5% от общего содержания железа в гемоглобине.

Пример 2. 3 г раствора гемоглобина (с характеристиками как в примере 1) при -7oC добавляют по каплям при непрерывном перемешивании и охлаждении в химический стакан с раствором 0,45 мл 1N соляной кислоты, 7,5 мл воды и 10 мл 96%ного этанола при -7ОС; После добавления температура стает -66С, а значение рН составляет 3,3. Содержание этанола в смеси доводят до 50 об.%.

Смесь, имеющую черно-коричневый цвет, центрифугируют при 10000 в течение 10 мин и получают черную пасту с количеством сухого вещества

0,03 г и светло-желтую жидкость поверхностного слоя.

Жидкость поверхностного слоя разделяют на две равные части. Из одной части. осаждают при рН 7,5 серый осадок, который после выделения центрифугированием и сушки дает 0,12 г сухого вещества.

Другую часть смешивают с 5 мл этанола и 0,2 мл хлористого натрия в 10%-ном водном растворе при непрерывном перемешивании и охлаждении и подвергают ультрафильтрации при температуре -6 С в ячейке Амикон

Диафлоу (.Amicpn Diaf2o) с мембраной

ХМ 300. Получают фильтрат светложелтого цвета, при этом мембрана покрыта темной пленкой. Из фильтрата после разбавления водой до содержания воды 50% и при рН 7,5, осаждают осадок, цвет которого от белого до светло-серого, из которого после выделения центрифугированием и сушки получают 0,11 r сухого вещества.

Пример 3. 3 г раствора гемоглобина (с такими же характеристиками, как и в примере 1) при 4 С

1071208 добавляют по каплям при непрерывном перемешивании и охлаждении в химический стакан с раствором 0,45 мл ледяной уксусной кислоты, 0,8 мл воды и

5 мл 96Ъ-ного этанола при -4 С..После добавления температура составляет

-4 С, а значение рН 3,8. Содержание этанола в смеси составляет 62 об.Ъ.

Черно-коричневую смесь центрифугируют при 27000 8 в течение 10 мин и получают черную пасту с содержанием сухого вещества 0,11 r и свет-. ло-желтую жидкость поверхностного слоя.

Из жидкости поверхностного слоя после разведения водой до содержа- 15 ния воды 50% и при значении рН 7,5 осаждают осадок, имеющий цвет от светло-коричневого до серого, из которого после центрифугирования и сушки получают 0,25 r сухого вещества.

Пример 4. 3 г раствора гемоглобина (с такими же характеристиками, как и в примере 1) при -8 C добавляют по каплям при непрерывном перемешивании и охлаждении в химический стакан с раствором 0,45 мл

1М соляной кислоты, 0,2 мл 20Ъ-ного водного хлористого натрия и 10 мл

96%-ного этанола при -15 С. После добавления температура составляет

-10 С, а значение рН 3,3. Содержание этанола в смеси составляет 77 об.Ъ.

Смесь черно-коричневого цвета центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин и получают черную пасту 35 .с содержанием сухого вещества 0,09 г

:и жидкость поверхностного слоя, имеющую цвет от светло-желтого до светло-коричневого.

Из жидкости поверхностного слоя после разбавления водой до содержания воды 50Ъ при значении рН 7,5, осаждают серый осадок, из которого после центрифугирования и сушки получают,0,30 r сухого вещества. 45

Пример 5. 6 мл 96Ъ ного этанола добавляют по каплям при,непрерывном перемешивании и охлаждении в химический стакан с 3 г раствора гемоглобина (с такими же харак- 5() теристиками, как и в примере 1).

Температура составляет -10 С. В эту суспензию гемоглобина капают при непрерывном перемешивании и охлаждении 0,4 мл 1М соляной кислоты в

3 мл 96Ъ-ного этанола. После добавления температура стает -10 C, а .значение рН 3,4. Содержание этанола в смеси составляет 77 об.%.

Черно-коричневую смесь центрифу. гируют при 20000 я 10 мин и получают 60 черную пасту с содержанием сухих веществ 0,08 г и светло-желтую жидкость поверхностного слоя.

0,19 мл 0,5М гидрата окиси натрия в 10 мл 96Ъ-ного этанола добавляют по каплям при непрерывном перемешива- нии и охлаждении в жидкость поверхностного слоя. После добавления температура составляет -10 C, а значение рН 4,35. Содержание этанола в смеси составляет 85 об.%.

Полученный осадок, фракцию протеина крови с адсорбированными соединениями железа удаляют центрифугированием и получают черно-красную пасту с содержанием сухого вещества 0,08 r.

Из очень слабо желтоватоокрашенной жидкости поверхностного слоя после добавления воды до содержания воды 50% и увеличения рН до 7,5 при непрерывном охлаждении, осаждают светло-серый осадок, из которого после отделения центрифугированием и сушки получают 0,22 r сухого вещества.

Пример 6. 3 r раствора гемоглобина (c такими же характеристиками, как и в примере 1) при -8 С добавляют по каплям при непрерывном перемешивании и охлаждении в химический стакан с раствором 0,45 мл

1Ы соляной кислоты и 10 мл 96%-ного этанола при -8 С. После добавления температура стает -8ОС, а значение рН 3,3. Содержание этанола в смеси составляет 78 об.Ъ.

Черно-коричневую смесь центрифугируют при 10000 g 10 мин, в результате чего получают черную пасту с содержанием сухого вещества 0,06 г и светло-коричневую жидкость поверхностного слоя.

1 мл суспензии с 0,1 г пульпы красных кровяных телец в равных объемах этанола и воды при -8 С и при рН 5,3 добавляют по каплям при непрерывном перемешивании и охлаждении в жидкость поверхностного слоя. После добавления температура стает

-8ОC,а содержание этанола составляет

75 об.Ъ. смесь центрифугируют при 10000

10 мин, в результате чего получают небольшое количество черной пасты и жидкость поверхностного слоя, имеющую цвет от светло-коричневого до светло-желтого. Из жидкости поверхностного слоя осаждают тем же способом, как .и в примере 5, светлосерый осадок, из которого после выделения центрифугированием и сушки получают 0,25 r сухого вещества.

Пример 7. 3 г раствора гемоглобина (с теми же характеристиками, как и в примере 1) при -6 С добавляют по каплям при непрерывном перемешивании и охлаждении в химический стакан с раствором 0,50 мл

1М соляной кислоты, 8 мл 96%-ного, этанола и 2 мл глицерина при -8 OC.

После добавления температура стает

-8 С, а значение рн 3,1. Полное ко

1071208

BHHHIIH 3azaa 11713/55 ТиРаж 688 Подписное филиал ППП "Патент", r. ужгород, ул.Проектная, 4 личество этанола и глицерина в смеси составляет 82 об. 4. х . Черно-коричневую смесь центриФугируют при 27000 g в течение

10 мин и получают черную -пасту, содержащую сухого вещества 0,09 г .5 и жидкость поверхностного слоя, имеющую цвет от светло-коричневого до светло-желтого.

Из жидкости поверхностного слоя осаждают таким же способом, как и 10 в примере 5, светло-серый осадок,из которого после выделения центрифугированием и сушки получают 0,26 г сухого вещества.

АналоГичным образом проводятся опыты с добавлением этиленгликоля, пропанола, изопропанола, метанола, ацетона и этилацетата в тех же количествах, что и с добавкой глицери-1 на. Результаты такие же.

Пример 8. В раствор 20 мл

96%-ного этанола и 1,1 мл 1N соляной кислоты, при -12 С добавляют по каплям при непрерывном перемешивании и охлаждении 5 r раствора гемоглобина .(с теми же характеристиками, что и в примере 1). После добавления значение рН стает 2,9, а температура -12 C. Содержание этанола в смеси составляет 80 об.Ъ. Смесь черно-коричневого цвета центрифугируют .при 30

27000 g 10 мин и получают 2,,2 г черной пасты с содержанием сухого вещества 2,7% и светло-коричневую жидкость поверхностного слоя. Жидкость впоследствии приобретает геле- З5 образную консистенцию.

В жидкость поверхностного, слоя добавляют по каплям при непрерывном перемешивании и охлаждении 70 мл ,холодного 96%-ного этанола, а после 40 этого 0,8 мл 40%-ного раствора сульфата аммония (водный раствор} и 8 мл воды. Температура после добавления стает -6 С. Осадок центрифугируют при 8000 g в течение 10 мин и получают 1,7 г белой пасты с содержа- 45 нием сухого вещества 36%.

Пример 9. 3 r раствора ге- моглобина (с теми же характеристиками, что и в примере 1) при +8ОС добавляют по каплям при непрерывном 50 перемешивании в химический стакан с раствором 0,80 мл 1М соляной кислоты, 2 мл воды и 10 мл 96%-ного этанола при +2 C. После добавления температура составляет +8ОС, а значение55 рН 2,5. Содержание этанола в смеси .составляет 67 об.Ъ.

Черно-коричневую смесь центрифугируют при 27000 g в течение

10 мин при +8 C и получают черную пасту с содержанием сухих веществ

0,06 r и желтую жидкость поверхностного слоя»

Из жидкости поверхностного слоя осаждают таким же образом, как в примере 5, светло-серый осадок, из которого после выделения центрифугированием и сушки получают 0,27 г сухого вещества.

Пример 10. 3 г раствора (гемоглобина (с теми же характеристиками, что и в примере 1) добавляют по каплям при непрерывном перемешивании и охлаждении в химический стакан с раствором 0,35 мл 2М соляной кислоты и 5 мл чистого этанола при -12ОС. После добавления температура стает -12 C, а значение рН 2,9. Содержание этанола в смеси составляет 71 об.В. Черно-коричневый раствор центрифугируют при

27000 g 10 мин при -12ОС и получают черную пасту с содержанием сухого вещества 0,07 г и светло-желтую жидкость поверхностного слоя.

15 мл 963-ного этанола при -18oC добавляют по каплям в жидкость поверхностного слоя при непрерывном перемешивании и охлаждении. После добавления температура составляет -18 С..

Содержание этанола в смеси составляет 86 об.Ъ.

После 10 ч при -18 C смесь центрифугируют, как указано выше, и получают черно-красную пасту с содержанием сухого вещества 0,08 r .

Очень слабо окрашенную светложелтую жидкость поверхностного слоя разделяют на две равные части.

Из одной части осаждают таким же образом, как и в примере 5, осадок, имеющий цвет от светло-серого до белого, из которого после выделения центрифугированием и сушки получают

0,11 г сухого вещества.

Другую часть подвергают ультрафильтрации в ячейке Амикон Диафлоу (Аш соп 01а 1о ) с мембраной РМ 10 при -8 С. Концентрат смешивают с.

10 мл воды при 0 С и отфильтровывают.

Раствор протеина, лишенный таким образом этанола, нейтрализуют, высушивают и получают 0,06 г сухого вещества.

Изобретение позволяет испольэовать простой технологический процесс, который является технически и экономически выгодным способом отделения компонента железа от глобина, позволяющим использовать глобин для корма или в качестве продукта питания, а компонент железа — в пищевой и в фармацевтической промышленностях.