Способ определения концентрации ионов щелочных,щелочно- земельных металлов и аммония в биологических жидкостях

 

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ ЩЕЛОЧНЫХ, ЩЕДОЧНОЗЕМЕЛЬНЫХ МЕТАЛЛОВ И АММОНИЯ В ШОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ путем ; спектроскопического исследования пробы, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, осуществляют взаимодействие исследуемой пробы с комплексным лигаидом , выбранньм из группы: кроненэфиры , криптанды или потанды, а также их производные, содержащие химические мостики или депи с олигоили полиэтиленгликолевым группами, цик-г лическим пептидом,, содержащим тетрагидрофурая , сложноэфирно-связакный макролид, валн1го а цин или нонактии, а также хромофор, выбрант из группы веществ, обладаощих полнеиовой , хиноновой, аэо-индофеяольной, стильбеновой или цианиновой структурой , или их литиевых, натриевых, калиевых, аммониевых, кальциевых или магниевых солей, причем хромофор и лиганд берут в соотноаении 1:1 на 100 или более частей исследуемой пробы. СО 2. Способ по п.1, отличающий с я тем, что осуществляютвзаимодействие исследуемой пробы с комплексным лигандом, нанесенным на впитывающий носитель.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„,80„„11354

4(51) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ / ..,,,;!

К AATEHTV (21) 2829004/28-13 (22) 01 ° 10. 79 (Э1) P 2842862.8 (32) 02.10.78 .(33) ФРГ (46) 15.01.85. Бюл. я 2 (72) Фридрих Фегтле, Иоханнес Петер

Дикс н Дитер Яворек (ФРГ) (71) Берингер Маннхайи, ГМБХ (ФРГ) (53) 616»07 (088.8) (56) 1. Биохимические методы исследования в клинике. И., 1969, с. с. 419-426 (прототип). (54)(57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ ЩЕЛОЧНЫХ, ЩЕЛОЧНО»

ЗЕМЕЛЬНЫХ МЕТАЛЛОВ И АММОНИЯ В БИОЛО. ГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ путем,спектроскопического исследования пробы, о тл и ч а ю шийся теи, что, с целью повышения чувствительности способа, осуществляют вэаимодействие исследуемой пробы с комплексным лигандом, выбранивши из группы: кронен эфиры, криптанды или потанды, а такае их производные, содеркащие химические мостики илн пепи с олиго- или полиэтиленгликолевыии группаии, циклическим пептидои, содераащим тетрагндрофуран, слоаноэфирно-связанный макролид, валиноэаецин или нонактин, а такне хроиофор, выбранный иэ группы веществ, обладающих полненовой, хиноновой, аэо-иидофенольной, стильбеновой нли цианиновой структураА, иле нх литиевых, натриевых, калиевых, аимониевых, кальциевых или магниевых солей, причем хроиофор и лиганд берут в соотиоаенни 1г1 на 100 или более частей исследуемой пробы °

2. Способ по н.1, о т л и ч а юшийся тем, что осуществляют= взаимодействие исследуемой пробы с комплексным лигандои, нанесенным на впитывающий носитель. 135436 2

Изобретение относится к клинической биохимии, в частности, к способу определения концентрации ионов щелочных, щелочноземельных металлов и аммония в биологических жидкостях.

Известен способ определения концентрации ионов щелочных, щелочноземельных металлов и аммония в биологических жидкостях путем спектроскопического исследования пробы (11. 10

Однако известный способ отличается длительностью осуществления, трудоемкостью, низкой чувствительностью, а также требует специальной аппаратуры.

Целью изобретения является повы- 15 шение чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения концентрации ионов щелочных, щелочноземельных металлов и аммония в био- 20 логических жидкостях путем спектроскопического исследования пробы осуществляют взаимодействие исследуемой пробы с комплексным лигандом, выбранным из группы: кронен-эфиры, криптанды или потанды, а также их производные, содержащие химические мостики или цепи с олиго- или полиэтиленгликолевыми группами, цикли,ческим пептидом, содержащим тетрагид- 30 рофуран, сложноэфирно-связанный макролид, валиномицин или нонактин, а также хромофор, выбранный из группы веществ, обладащих полиеновой, хиноновой азо-индофенольной, стильоеновой или цианиновой структурой, или их литиевых, иатриевых, калиевых, аммониевых, кальциевых или магниевых солей, причем хромофор и лиганд берут в соотношении 1:I на 100 или более №0 частей исследуемой. пробы.

Кроме того, осуществляют взаимодействие исследуемой пробы с комплексным лигандом, нанесенным на впитывающий носитель. №5

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве селективных комплексных лигандов берут циклически или ациклические высокомолекулярные со- 50 единения со средним молекулярным весом, которые по отношению к определяемому иону выступают как комплексообразователи или как молекулахОзяин и в их присутствии прини 55 мают необходимую для комплексообразования или образования аддукта. структуру взаимодействия "гость" -

"хозяин". Так, н качестве комплексных лигандов или молекул-"хозяев" пригодны соединения типа простых олигоэфиров, простых полиэфиров, сложных олигоэфиров, сложных полиэфиров, олигоамидов и полиамидов.

Хорошо пригодны, например, простые кронен-эфиры, криптанды, потанды или их производные, а также циклические пептиды или пептиды, которые в присутствии определяемого иона или полярного вещества принимают необходимую для комплексообразования вторичную, третичную или четвертичную структуру. Кроме того, используют содержащие тетрагидрофуран ,сложноэфирно-соединенные макролиды и аналогичные соединения, которые могут регулировать в биологических системах транспорт ионов, а также чистые углеводородные каркасы как молекулы-"хозяева (липофильные пустоты), циклодекстрины, циклофаны.

Возможны также комбинации указанных соединений.

Производные комплексных лигандов или молекул-"хозяев" могут иметь мостики или цепи, которые могут содержать олиго- или полиэтиленгликолевые группировки или другие содержащие гетероатом группировки.

Ковалентно, гетерополярно или гидрофобно связанный хромофор представляет собой краситель, флуоресцентный краситель или хромоген, абсорбционный спектр которого изменяется за счет такого взаимодействия, как смещение заряда и нарушение мезомерии в основном либо в возбужденном состоянии благодаря "гостевым" частицам (полярным ионам или липофильным "гость"-молекулам). В качестве красителей используют например, тактовые полиенового, мерихиноидного, хинонового, азо- (как метилорань или метилрот), пирролового, мероцианинового, индиго-, индофенолового, стильбенового, азометинового, антрахинонового, нафтохи онового, цианинового, фталеинового, полиметинового, ализаринового типа.

Содержащийся в комплексе-включении или в молекуле-"хозяине" хромофор может быть кислым красителем или его солью, например литиевой, натриевой, калиевой, аммониевой, кальциевой, алкиламмониевой или магниевой

113543Ü солью. Краситель при этом содержит гредпочтительно карбоксилатную, сульФонатную,фенолятную или тиофенолятную группировку. Определяемые ионы могут быть катионами и анионами, прежде всего ионами щелочных металлов (лития, натрия, калия), аммония щелочноэемельных металлов (маг1 ния и кальция) или другими металлическими ионами, например ионами !О тяжелых металлов (железа, цинка, меди, кобальта, никеля, молибдена и хрома). Прежде всего определяются органические катионы, например ионы олигоалкиламмония, фосфония, гуани- 15 дина, хиналина. В качестве определяемых анионов нужно назвать хлорид-, бромид-, иодид-, сульфат-, нитрит-, нитрат-, фосфат-, дифосфат-, трифосфат-, гидрофосфат-, гидрокарбо- 20 нат-ионы. В качестве нейтральных полярных веществ используют нейтральные "гость"-частицы, например мочевину, тиомочевину, гуанин, гуанидин, мочевую кислоту, холин, креа- 25 тинин, амино-кислоту, сахар; в качестве типичных липофильных "гостевых" молекул — стероиды (холестерин) и липиды (триглицериды, лецитины}.

Концентрацию катионов и анионов, щ а также концентрации нейтральных

"гостевых" частиц можно определять качественно и количественно предлагаемым способом благодаря эффектам расцветки (фотометрически).

33

Ао о причем Me+ может означать, например, ион щелочного, шелочноземельного

v металла, аммония или ион тяжелого металла, причем в основе лежит систепричем m означает числа 0-4.

Химия простых кронен-эфиров, криптандов и потандов охватывает

Селективность может относиться . как к отдельному, определенному иону или определяемому веществу, так и к группам ионов или к группе веществ.

Для этого применимы, например, такие хромофоры, как красители с несколькими одинаковыми или разными комплексными лигандами или молекулами"хозяевами", например простыми кроненэфирами с различными размерами пустот, как в формуле причем 1,,tn и и предпочтительно означают числа 0-4.

Далее, на комплексном лиганде или молекуле-"хозяине", например каркасе. простого кронен-эфира, могут .ахо- . диться один или несколько одинаковых или разных:хромофоров (красителей).

Изменение окраски может основываться. например, на следующем механизме согласно формуле (Й ): о о ... Р )-и не о (Ь

lo od ма мезомерии согласно формуле ((), вес и содержание энергии которой . в основном и возбужденном состоянии, как правило, различны: (61 множество методов связывания более .крупных и средних колец, а также бии трициклических систем с (СН )-, 1135436 арил- и гетероатом-содержащими структурными элементами.

Простые кронен-эфиры (корончатые эфиры), криптанды и патанды-молекулы обладают способностью образования стехиометрических кристаллических комплексов, а также селективным или специфическим комплексованием, например, ионов щелочных, щелочноземельных металлов, аммония и тяже- 10 лых металлов, а также нейтральных молекул.

Получен ряд аэо-, ди- и трифенилметановых красителей из структурного элемента согласно формуле (Y ) t5 (Р,-водород, и = 1-3) и формуле (Iv ).

На этих аэокрасителях можно, в зависимости от размера кольца, наблюдать. селективный, специфический для каждого иона сдвиг видимого максимума 20 абсорбции в определенном направлении, который часто связан с изменением мсатярной экстинкции. Большинство спектральных изменений („,д„ ) вызывает, как правило, оптимальйо г 25 пригодный для определенного кольца простого кронеи-эфира из соответствующей группы периодической системы относительно радиуса катион. он о (ф ) „

Изобретение охватывает также использование комплексных лигандов в форме циклического пептида или пептида, который s присутствии иона или полярного вещества принимает не- 50 абходимую вторичную, третичную или . четвертичную структуру. Так, могут применяться ионоформы природных веществ {валиномицин, нонактин, грамацидин и подобные пептиды) для 55 предлагаемых согласно изобретению ионоселективных цветных реакций или цветного теста. В валиномицин включается соль красителя, например

2,4-динитрофенилгидроазонийхлорид, пикрат натрия или подобный краситель.

Комплекс валиноцимин-красите lb имеет другой цвет или другой максимум абсорбции по сравнению с свободным красителем. Во второй стадии к комплексу валиномицин-краситель добавляют солевой раствор, в котором определяют концентрацию, причем специфический для калия налиномицин ксмплексуют имеющиеся в растворе ионы калия, благодаря чему краситель вытесняется иэ пустоты валиномицина и раствор снова приобретает другую окраску или другой спектр абсорбции.

Таким образом, для теста окраски можно использовать специфичность к калию валиномицина, В качестве простой системы красителя, которая пригодна для внедрения или присоединения к валиномицину и -последующего вытеснения ионами калия, можно использовать соли гидразиния с различными связанными мезомерными системами, например с аэо-функциями.

Применяют стерически малотребовательные катионы красителей, которые образуют с валиномицином слабо, однако достаточно стабильный комплекс, который затеи можно количественно разрушать с помощью ионов калия, также в незначительной концентрации.

Аналогичные, опыты с кронен-эфирами, например с кронен-эфиром (18)-крон-б, которые имеют срачнимую структуру, (валиномицин и нонактин) позволяют установить отчетливые эффекты расцветки или изменения более длинноволновой абсорбции красителя в связанном с кронен-эфиром н в свободном состоянии. Применение как катнонных солей красителей (ионов

2,4-динитрофенилгидразония), так и ачионных хромофоров (пикрат-ионов) дает возможность выбора в соответствии с используемыми компонентами.

П р и и е р 1. Фотометрическое определение калия с помощью ионоселективного красителя, который содержит хромофор, ковалентно связанный через мезомерную систему.

Ионоселективный краситель формулы (И ), где и = 1, растворяется в хлороформе и встряхивается с раствором, содержащим ионы калия. Закомплексованный с калием краситель ггереходит в водную фазу и может количест1135436 венно определяться при 60 нм на фотометре в зависимости от активности имеющихся ионов калия.

Краситель |.5-нитро-1,3-тиазол-2-азо-(3-) 12-окси-i,4,7, 10-тетраокса- 5 додецил/4-оксибензол3 получают путем введения во взаимодействие 2-амино-5-нитротиазола в 85Х-ной фосфорной кислоте с нитритом натрия и последующей добавки бензо-(15)-крона-5. Суспензию интенсивно красного цвета смешивают с водой и экстрагируют хлороформом. После высушивания над сульфатом натрия и удаления растворителя в вакууме разделяют на силика- 15 геле с помощью колоночной хроматографии. С помощью хлороформа получают сначала краситель с замкнутым циклом 15-нитро-1,3-тиазол-2-азо-/ 1,4, 7, 10, 13-пентаокса/13/3,4/-бен- 20 зофан/). Путем добавки SX этанола к элюенту получают открытоцепной краситель формулы (.IV ), где n = 1.

Пример 2. Для исследования свойств указанного в примере 1 ионоселективного красителя ленточным тестом раствор красителя наносят путем накапывания на полоски фильтровапьной бумаги и эти полосы высушивают. Обработанные таким образом 3Q полосы бумаги окрашиваются в темнокрасный цвет при добавке испытуемых растворов, которые содержат ионы калия. Наряду с этим качественным методом окрашенные полосы можно оценить количественно в отражательном фотометре.

Пример 3 ° Селективное фотометрическое определение калия с помощью лиганда, который содержит кова- 4р лентно связанный хромофор (соединение формулы (iV ), где и = 1 и Н„= 0,2)

В течение 3 ч подвергают взаимодействию 2,4-динитротолуол с N --(и-формилфенил)-аза(15)кроном-5, с несколькими каплями пиперидина при о

100 С. Застывший расплав растворяют в небольшом количестве уксусного эфира, фильтруют и концентрируют в вакууме. Очищают с помощью колоноч- у> ной хроматографии на силикагеле с помощью смеси уксусный эфир . — 5-10Х этанола. При концентрировании элюента выкристаллизовывается 2, 4-динитро-4-(4,7, 10,13-тетраокса-1-азо1

-циклопентадец-1-ил) стильбен.

7,5 мп красителя растворяют в

250 мл метанола. Кроме того, готовят

О, 1 М растворы хлористого кальция, хлористого натрия, хлористого калия, хлористого лития и хлористого магния в О, 1 М буфере триэтаноламингидрохлорид/МаОН с рН 7,0. Кроме того, готовят ряд растворов с 0,00!—

О, 1 М концентрацией хлористого калия, в 0,1 М буфере триэтаноламингидрохлорид/NaOH с рН 7,0. 3 мл раствора красителя смешивают с 0,5 мп соответствующего исследуемого раствора соли и при 366 нм определяют абсорбционные свойства и фотометре.

Этот краситель показывает по отношению к калию другой спектр, чем в присутствии лития, натрия, кальция, бария и магния. Концентрация ионов . калия прямо пропорциональна экстинк. ции.

Пример 4. Фотометрическое определение кальция и лития с помощью гетероциклического простого кронен-эфира формулы (tg, ).

1,4-Бензохинон-(4,7,10,13-тетраокса-1-азоцикло-пентадец-1-ил)— фенилимин получают путем окислительного сочетания М-(4-амина-фенил)аза(15)-крона-5 с фенолом. Затем вводят во взаимодействие нитрат серебра с хлористым натрием и небольшим количеством крахмала, добавляют карбонат натрия и фенол и прикапывают раствор М -(4-амннофенил)-аза(15)-крона-5 в концентрированной соляной кислоте.

После взаимодействия перемешивают с уксусным эфиром, высушивают над сульфатом натрия и выпаривают в вакууме. Остаток кристаллизуют из тетрагидрофурана с эфиром.

Л „=538 нм, fog Е = 4,77, Краситель растворяют в хлороформе (Е 7 „ = 0,8) и смешивают с одинаковыми объемными частями водного солевого раствора. С литием и кальцием измеряют при 578 нм изменение окраски, концентрация которой прямо пропорциональна определяемым ионам.

Фотометрию проводят при = 577 нм, Йо E = 4,41.

Использование хромофорных криптандовых систем обеспечивает в водных средах наряду с более высокой устойчивостью комплексов лучшую селек» тивность. Наряду с качественным и количественным фотометрическим доказательством ионов щелочных и щелочноземельных металлов, а также ионов

113543б о" логические ткани от здоровых.

Составитель Н.Хрусталева

Редактор М.Циткина Техред О.Неце Корректор Л. Пилипенко

Заказ 10114/46 Тираж 898 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

9 аммония с помощью хромофоров-"хозя- ев" с различной величиной пустоты в растворах, например в крови или сыворотке и других жидкостях организма, их можно идентифицировать также на материалах носителя. При этом возможно применение в качестве распыляемого реактива для ионной хр матографии или силиконовых отпечатков, используемых в медицинской диагностике. По образцу термографии можно делать видимыми эа счет изменений цвета физиологические и патологические концентрации солей путем опрыскивания тканевых областей либо их отпечатков с помощью ионоселективных красителей или флуоресцирующих веществ. Благодаря этому создается воэможность отличать пато