Способ количественного определения фибриногена в плазме крови

 

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИБРИНОГЕНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ, включающий свертьтание фибриногена плазмы коагулирующий агентом с последующим количественным определением скоагулированного фибриногена , отличающийся тем, что, с целью повьгазения точности способа, определяют как свертьгааемый, так и несвертьшаемый тромбином фибриногены , а в качестве коагулирующего агента используют яд многочешуйчатой эфы (Echis multisguamatus).

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЯ4АЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

4(51)A 6 В 0 00 0

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPGHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3623734/28-13 (22) 13.07.83 (46) 23.03 ° 85. Бюл. К- 11 (72) 3.С. Баркаган и Л.П.Цывкина (7i) Алтайский государственный медицинский институт им.Ленинского комсомола (53) 577.157(088.8) (56) 1. Parfentjev et al.,-"АгсЬ.

Hiochem", 1953, 46, р. 2

2. Андреенко Г.В. "Лабораторное дело", 1962, N - 5, с. 3-6 (прототип). (54) (57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИБРИНОГЕНА В ПЛАЗМЕ

КРОВИ, включающий свертывание фибриногена плазмы коагулирующиМ агентом с последующим количественным определением скоагулированного фибриногена, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, определяют как свертываемый, так и несвертываемый тромбином фибри" ногены, а в качестве коагулирующего агента используют яд многочешуйчатой эфы (Echis multispuamatus). при 37 С. Затем сгусток, образовав1 шийся в пробирке, извлекают, промыва- ют в холодном растворе NaC1, сушат, отжимая на фильтровальной бумаге, и переносят в пробирку с 0,2 мл

0,.1М раствора МаОН. Пробирку помещают на 10 мин в кипящую водяную баню до растворения сгустка, затем в,пробирку вводят 6 мл 12,5Х-ного раствора

N 0g и t мл 0,1М раствора С БО, перемешивают 10 мин, добавляют 1 мл раствора Фолина-Чикалто, разбавленного 1:2 дистиллированной водой и через

30 мин определяют оптическую плотность раствора на фотоэлектрокалориметре с красным фильтром. По привой Разведений очищенного фибриногена показатели оптической плотности переводят в количество фибриногена, г/л.

Яд змеи эфы многочешуйчатой (Echis multisguamatus), обладая гемокоагулирующим действием, отличается от тромбина следующими свойствами: его действие не блокируется гепарином и комплексом антитромбин

Ш-гепарин, он коагулирует так называемый "заблокированный" или тромбинорезистетный фибриноген, т.е. фибриноген, входящий в фибрин-мономерные комплексы.

П. р и м е р 2. Сравнительное определение концентрации фибриногена тромбином и ядом многочешуйчатой эфы при блокировании коагуляции гепарином.

56 С в течение 5 мин); раствор тромбина активностью в 20 -5 с; рабочий раствор яда; разведения гепарина

0,1-1,0 ед/мл.

1146002 .2

Изобретение относится к медицине, в ча"тности к лабораторной диагности- ке нарушений свертываемости крови, Известен способ определения концентрации фибрииогена в плазме крови путем высаливания сульфатом аммония с последующим измерением коагулята фотокалориметрическим или спектрофотометрическим методом (1j .

Однако данный способ не обеспечи- 10 вает селективного определения фибриногена из-за частичного осаждения других белков плазмы.

Наиболее близким к изобретению по техничесаой сущности и достигаемому результату является способ количественного определения содержания фибриногена в плазме, включающий свертывание фибриногена естественным ферментом тромбином, который 2п обладает специфическим воздействием только на фибриноген и не коагулирует другие белки, с последующим фотокалориметрическим определением скоагулированного белка после его 25 гидролиза (2) .

Недостатками известного способа, являются невозможность определения .той части фибриногена, которая утра- тила способность свертываться тромбином, а также трудность сбора без потерь .слабоконсолидированных сгустков, образующихся при синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови и других видах

Исследования на смешанной нормальпатологии. ной плазме (источник фибриногена) .

Цель изобретения — повьппение точ- Реактивы: смешанная нормальная ности способа. плазма с 3,5 г/л фибриногена; источПоставленная цель достигается тем, ник антитромбина Ш-дефибринированная что согласно способу количественного плазма (плазма, проинкубированная прн определения фибриногена в плазме крови, включающему свертывание фибриногена плазмы коагулирующим агентом с последующим количественным определением скоагулированного фибриногена, 4 определяют как свертываемьй, так и Проводится параллельное определе45 несверть ваемый тромбином фибриногены, ние конЦентРаЦии фибриногена известа в качестве коагулирующего агента ным и пРеДлагаемым способами при используют яд многочешуйчатой эфы различных уровнях гепаринизации испы(Echis multisguamatus). туемых образцов плазмы.

Результаты проведенных исследоваПример 1. К 0,2 мл цитратной ннй представлены в табл, 1. ! плазмы добавляют 4,8 мл мединалового Из табл. 1 видно, что нй фоне гебуфера (РН 7,4), инкубируют смесь паринизации количество фибриногена о при 37 С в течение 5 мин, затем добав- свертываемого тромбином, прогрессивляют 0,1 мл рабочего раствора много- 55 но снижается начиная с концентрации

У чешуйчатой зфы (1 10 -5" 10 мг/мл), гепарина 0,3-0,4 ед/мл, а при перемешивают содержимое пробирки стек- 0,6 ед/мл не определяется в связи с ляной палочкой и инкубируют 10 мин полным блокированием свертывания. В

Из табл. 3 видно, что у здоровых людей определяется примерно одинакоотличие от этого у больных с помощью яда эфы выявилось достовернс большее тывании тромбином. После коагуляции тромбином и удаления образовавшихся сгустков при дополнительном введении яда Echis multisguamatus o6pasoaa es второй сгусток из тромбинрезистентного фибриногена. В разных случаях количество такого заблокированного фибриногена составило в среднем

1,27-0,78 г/л, т.е. достигало значительных величин ° При исследовании больньм в фазе полной несвертываемкости тромбином вызвать коагуляцию плазмы не удавалось, а яд эфы вызывал формирование плотного консолидированного фибринового сгустка.

Проведение этанолового теста после свертывания тромбином выявляло фибрин-мономерные комплексы у больных с ДВС-синдромом в 80Х случаев. В отличие от этого, после свертывания ядом эфы этаноловый тест всегда отрицательный, что говорит об осаждении заблокированного фибриногена и фибрин-мономерных комплексов этим коагулирующим агентом, Пример . 4. Практическое использование предлагаемого способа определения содержания фибриногена в плазме крови на больных.

Больная К.Н., 25 лет. Диагноз: беременность 29 недель, внутриутробная гибель плода, ДВС-синдром, маточное кровотечение несвертывающейся кровью.

Результаты лабораторного исследования системы гемостаза: аутокоагуляционный тест на 10-й мин 35 с: каолин-кефалиновое время свертывания

87 с (контроль 45 с); протромбиновое время 42 с (контроль 17); тромбиновое время 73 с (контроль 20 с); этаноловый тест — положительный.

Содержание фибриногена при коагуляции тромбином составило 0,70 г/л.

Сделано заключение о выраженной гипофибриногенемии. Определение ядом эфы выявило 2,5 г/л фибриногена.

Таким образом, с помощью яда выяви30

3 1146002 4 отличие от этого, при использовании Результаты проведенных исследовав качестве коагулирущего агента яда ний представлены в табл. 3.

Echis muktiseuamatus> гепаринизация не влияет на количественное определение фибриногена в тех дозах, кото- вое количество фибриногена при сверP ые полностью блокируют естественную тывании тромбином (известный метод) и ядом эфы (предлагаемый метод). В

Таким образом, предлагаемый метод позволяет определять концентрацию фибриногена в плазме даже при очень 10 количество фибриногена, чем при сверинтенсивной гепаринизации больньм, дающей полную несвертываемость крови.

Исследования на растворе очищенl ного фибриногена.

Реактивы: раствор очищенного 15 фибриногена, содержащий 94% свертываемого белка (по Лоури) в концентрации 4,0 г/л; источник антитромбина Ш-дефибринированная плазма; раствор тромбина, активностью 20- 5 с; рабочий раствор яда эфы; разведения гепарина 0,1-1,0 едlмл.

Параллельное определение концентрации фибриногена производится известным и предлагаемый способами при разных уровнях гепаринизации (табл. 2)

Из табл. 2 видно, что при коагу- ляции тромбином гепарин вызывает уменьшение количества определяемого фибриногена, тогда как с помощью яда выявляется весь введенный в сис1ему фибриноген (4,0 г/л).

Пример 3. Сравнительное определение содержания фибриногена при свертывании тромбином (известным 35 .способом) и ядом змеи Echis multisguamatus (предлагаемым способом) у больных с синдромом-диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдромом). 40

У этих больных выявилось более или менее выраженное блокирование

Фибриногена в фибрин-мономерных комплексах, что устанавливалось определением продуктов деградации фибриногена в плазме, а также по положительным результатам этанолового и протамин-сульфатного тестов. Контрольные исследования проводились на плазме здоровых людей. В двух опытных50 группах было 35 больных, в контрольной группе — 20 здоровых людей. Первую опытную группу составили больные с ДВС-,синдромами в фазе гипокоагуляции (20 человек), во вторую опытную 55 группу (15 человек) вошли больные с ДВС-синдромами с полной несвертываемостью крови.

1146002

20.

Т а б л и ц а 1

Количество фибриногена, г/л, при концентрации, ед/мл

Фибриноген

0,1 0,2 0,3 0,4 0 5 0,6 0,7 0,8 .0,9 1

Скоагулиро.ванный тромбином

3,5 3,5 3,0 2,2 1,3 Нет свертывания

Скоагулированный ядом многочешуйчатой эфы

3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 . 3,5 3,5 3,5 3,5

Ф .лось значительное количество фибриногена, не свертывающегося тромбином, в связи с чем сделано заключение об отсутствии истинной гипофибриногенемии,и наличии в плазме большого количества заблокированного фибриногена, количество которого составило по подсчету 2,5 г/л — 0,7 г/л =

1 8 г/л. Этаноловый тест после коагуляции тромбином оставался положи- 10 тельным, а после коагуляции ядом эфы становился отрицательным. Это позволило назначить адекватное лечение.

Больной К.С., 23 г. Диагноз: состояние после операции по поводу 15 аневризмы ветви легочной артерии, ДВС-синдром, массивное кровотечение из послеоперационного шва, синяки на теле.

Результаты лабораторного исследования системы гемостаза: аутокоагуляционный тест на 10-й мин — 17 с; каолин-кефалиновое время свертывания 50 с (контроль 45 с); протромбиновое время 25 с (контроль 18 с); 25 тромбиновое время 23 с (контроль

15 с); этаноловый тест положительный; при свертывании тромбином сформировался некачественный мелкозернистый сгусток, отжать и высушить gp который не удалось, ядом эфы определено 3,5 г/л фибриногена. Сделан вывод о массивном внутрисосудистом свертывании крови с образованием фибрин-мономерных комплексов и бло35 кированием в них фибриногена б

Больной P.À., 45 лет. Диагноз: острый недифференцированный лейкоз, ДВС-синдром, кровоизлияние в мозг с гемипарезом, желудочное кровотечение.

Синяки на теле, макрогематурия.

Результаты лабораторного исследования системы гемостаза: аутокоагуляционный тест на 10-й мин— нет свертывания: каолин-кефалиновое время свертывания — нет свертывания (контроль 50 с); проторомбиновое время 75 с (контроль 18 с); тромбиновое время 110 с (контроль 15 с); этаноловый тест положительный; фибриноген при свертывании тромбином . составил 0,5 г/л, при коагуляции ядом эфы 4,5 г/л. Количество заблокированного фибриногена составило

4,5-0,5 = 4,0 г/л. Назначенное лечение, соответствующее фазе ДВС-синдрома.

Предложенный способ обеспечивает повышение точности определения концентрации фибриногена в плазме за счет коагуляции как всертываемого, так и несвертываемого тромбином (тромбино-резистентного) фибриногенов, что имеет важное значение в диагностике массивного тромбоза, диссеминированного внутрисосудистого свертывания. крови, дифференциации этих состояний с гипергепаринемией, что весьма важно для диагностики и лечения.

1146002

Количество фибриногеиа, г/л, при концентрации, ед1мл ! t фибрнноген

0,1 6,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

4,0 4,0 4,0 3,0 2,5 1,0 0,7 Нет свертывания

4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0

Таблица 3

Количество фибриногена, г/л

Коагулирующий агент

Больные, группа 1

Больные, группа 2

Контроль, здоровые лк>ди

2,7

2,0-4,0

Тромбин

Яд многочешуйчатой эфы

2,0-4,5

1,5

3,6

0 05

1,5

0,90

Разница

Свертывание ядом . эфы после тромбина (дополнительное количество фибриногена) 1 5

0,86

Свертывание тромбином после яда эфы

Свертывание этанолом после тромбина (Ж положительных реакций) 0

Свертывание этанолом после я а э ы

Редактор А. Козориз

Корректор М. Розман

Заказ 1244/3

Тираж 722

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Скоагулированный тромбином

Скоагулированный ядом многочешуйчатой эфы

Составитель Е. Пазин

Техред Л.Иартяшова

"Габлица 2