Способ определения креатинина в сыворотке крови

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КРЕАТИНИНА В СЬгаОРОТКЕ КРОВИ, о т л ич а ю щ и и с я тем, что, с целью повьшения специфичности способа, к пробе добавляют гфеатининаминогвдролазу , инкубируют при рН 7,8-8,3 в течение 45-60 мин при 37°С и по уровню уменьшакщегося креатинина или образовавшегося креатина определяют креатинин в пробе. i w

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

DNN

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ

К llATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 1 777222/28-13 (22) 17.04.72 (31) Р2122 255.9 (32) 05.05.71 (33) ФРГ (46) 07.03.85. Бюл. У 9 (72) Аугуст Валефельд Меллеринг, Эрих Бернт, Вольфганг Грубер и Ханс Ульрих Бергмайер (ФРГ) (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (ФРГ) (53) 616.07(088.8) (56) 1. Биохимические методы исследования в клинике. N. 1969, с. 103105, „„SU„„1144629 А (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КРЕАТИНИНА В СЬБОРОТКЕ КРОВИ, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения специфичности способа, к пробе добавляют креатининаминогидролазу, инкубируют при рН 7,8-8,3 в течение 45-60 мин при 37 С и по о уровню уменьшающегося креатинина или образовавшегося креатина определяют креатинин в пробе.

1144629

55

Изобретение относится к медицине, а именно к способу для специфического ферметативного определения креатинина.

Известен способ определения креатинина путем смешивания креатинина с щелочным пикратом (1) .

Однако данный способ является недостаточно специфическим при выявлении креатинина в сыворотке крови.

Цель изобретения — повышение специфичности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определе— ния креатинина к пробе добавляют креатининаминогидролазу, инкубируют при рН 7,8-8,3 в течение 45-60 мин при 37 С и по уровню уменьшающегося креатинина или образовавшегося креатинина определяют креатинин в пробе.

Способ осуществляют следующим образом.

Фермент — креатининаминогидролаэу получают по известному методу.

Этот фермент катализирует реакцию:

Креатинамидогидролаза

Креатиниитр;О Креатин

Образовавшийся креатин можно измерить известными способами, йапример, фосфорилированием креатиновой киназой и аденозинтрифосфаточ (АТФ) с образованием аденозиндифосфата.

Другая возможность состоит в измерении уменьшения количества креатинина по Жафе.

Способ осуществляют при рН между

7,8 и 8,3. Для установки величины рН можно применять любые буферные растворы. Однако следует обращать внимание на то, чтобы применяемый буфер не препятствовал используемому методу определения. Если, например, затем по Жафе определяют изменение содержания креатинина, нужно применить буфер, который не подавляет реакцию Жафе. Неблагоприятные для реакции, например, глициновые и глицилглициновые буферные растворы.

Предпочтительными являются фосфатные и пирофосфатные буферы. Однако если определение производится не по Жафе, а образовавшийся креатин определяют с помощью креатиновой кинаэы и АТФ, то можйо применять также глициновые и им подобные буферные растворы.

Согласно предлагаемому способу предварительное отделение белка не требуется. Однако отделение белка целесообразно для последующего определения креатина. е

Креатин переводят при применении фермента креатиназы в саркозин и мочевину и последнюю определяют с помощью известных методов.

Этот вид осуществления способа применяется для определения фермента, содержащего креатинкиназу и креатинаэу в смеси.

Если образовавшийся креатин определяют известным способом с применением креатиназы и АТФ, то отделение белка выгодно, так как благодаря этому повышается чувствительность теста.

Применение фермента, содержащего креатинамидогидролазу и креатиназу, предпочтительно, когда определение креатинина производится по Жафе, так как благодаря креатиназе равновесие перемещается в сторону образования креатина.

Изобретение создает также новую комбинацию реактивов для специфического определения креатинина, которая состоит иэ креатинового стандарта, пикриновой кислоты, едкого натра, креатининамидогидролазы (одной или вместе с буфером), а также в том или ином случае креатиназы, в не смешиваемом до употребления состоянии. Кроме того, комбинация состоит иэ буфера, восстановленного никотинамид — аденин-динуклеотида (NADN), ATP и фосфоенолпирувата (ФЕП): лактатдегидрогенозы (LDH), пируваткиназы (PK) и MgC32; креатинкинаэы (СК), креатининамидогидролазы в не смешиваемом до употребления состоянии.

Пример 1. Определение с непосредственно, следующим применением реакции Жафе.

i,0 мл содержащей креатинин пробы (сыворотка или разбавленная моча) инкубируют в 0,050-0,2 M буфера (особенно пригодны пирофосфатный, фосфатный, диэтаноламин) HCR, или глицилглицин (HCC — буфер) креатининамидогидролазой в количестве минимум 5 U(тест),,1 U = 1 ммоль, превращенного субстрата за 1 мин и креатиназой в количестве минимум

0,8 U (тест) при 37 С в течение 45О, Составитель Н.Хрусталева

Редактор Т.Кугрышева Техред 3.Палий КоРРектоР .С.Шекмар

Заказ 965/46 Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4.!5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãîðoä, ул.Проектная, 4

60 мин. Затем производят отделение белка с помощью 3 М трихлоруксусной кислоты вместе с пробой, к которой не прибавляют смеси ферментов. В надосадочной жидкости обеих проб проводят реакцию Жафе. Из разности экстинкций обеих проб при 546 щ получается количество креатинина по отношению к стандартной величине креатинина. Реакцию окрашивания по Жафе проводят путем добавления пикриновой кислоты и NaOH, выдержки в течение

15 мин при комнатной температуре и измерения в кювете с толщиной слоя

2 см при 546 q .

Пример 2. Измерение креатина с помощью креатинкиназы.

С помощью креатинкиназы креатинин гидролизуется в креатин и образовавшийся креатин фосфорилируется по известной методике креатинкиназой и АТФ. Образовавшийся АПФ превращается посредством ФВК и ПК в АТФ и при этом получившийся пируват восстанавливается посредством NADH и лактатдегидрогеназы в лактат при

44629 4 образовании NAD. Обмен 1 ммоль

NADH, измерение при 334, 340 или

366 пуп (соответствует присутствию

1 ммоль креатинина).

Для определения смесь реактивов, содержащая NADH, ATP, PEP и хлорид магния в О, 11 М буфера при РН 9,0 смешивают с лактатдегидрогеназой (LDH), пируватки .азой (PK) и термо-!

О статируют до 25 С. Затем добавляют о сыворотку и креатинкиназу, и при указанной температуре производят инкубирование максимум в течение 30 мин.

Путем добавления минимум 5 U креатин15 киназы начинают реакцию. Падение экстинкции регистрируют. Продолжительность реакции составляет 4090 мин. Содержание креатина вычисляют непосредственно по молярным ко2О эффициентам экстинкции NADH.

Преимуществом данного способа является повышение специфичности определения креатинина, упрощение по сравнению с базовым способом, 25 отсутствие необходимости отделения белка в сыворотке крови.