Способ определения метаболитов витамина д в сыворотке крови

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ ВИТАМИНА D В СЫВОРОТКЕ КРОВИ путем добавления к образцу внутреннего стандарта, экстракции липидной фракции, хроматографической очистки на колонке с силикагелем с последующей элюцией и высокоэффективной жидкостной хроматографии, отличающий ся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве внутреннего стандарта используют 17-ацетат эквиленола, а элюцию с колонки с силикагелем проводят последовательно смесью гексан:хлороформ в объемном соотношении 100:2, смесью гексан:хлороформ:уксусная кислота в соотношении 100:10:2, хлороформом, смесью хлороформ:ацетон в соотношении 100:10 и смесью хлороформ:ацетон: уксусная кислота в соотношении 50:50:1. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦ)ИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) ГОСУДАРСТВЕННЬЙ КОМИТЕТ СССР . ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГП Й

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

М IEBTGPCHONIV СВИДЕТВВСТВУ (21) 3605189/28-13 (22) 08.06.83 (46) 15.02.85. Бюл. 1(- 6 (72) Ю.П.Архапчев, Л.Ф.Линберг, А.С.Ииримский и В.Б.Спиричев (71) Институт питания AMH СССР (53) 543.544+577. 16(088.8) (56) 1. Cilbertson Т., Stryd R.P.

High-Performance Zignid choromatographyc Assay for 25-Hydroxyvitamin

D> in Serum. "Clinical Chemistry", 1977, v. 23, р. 1700-1704. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЕТАБОЛИТОВ BHTAMHHA D В СЫВОРОТКЕ КРОВИ путем добавления к образцу. внутреннего стандарта, экстракции липидной

4(5() G 01 N 33/48; С 07 С 172/00.фракции, хроматографической очисткн на колонке с силикагелем с последующей элюцией и высокоэффективной жидкостной хроматографии, о т л ичающий с я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве внутреннего стандарта используют 17-ацетат эквиленола, а элюцию с колонки с силикагелем проводят последовательно смесью гексан:хлороформ в объемном соотношении 100:2, смесью гексан:хлороформ:уксусная кислота в соотношении 100:10:2, хлороформом, смесью хлороформ:ацетон в соотношении 100:10 и смесью хлороформ:ацетон: уксусная кислота в соотношении

50:50:1.

1 1140

Изобретение относится к аналити" ческой химии и может быть использовано в биохимии при исследованиях метаболитов витамина D.

В настоящее время известно около двух десятков метаболитов витамина D. Предлагаемый метод относится к определению трех важнейших из них. .Это 25-оксихолекальциферол/25 (ОН)Р /, 1,25-диоксихолекальциферол/ " 10 (t1,25(OH) Dg/ и 24,25-диоксихолекальциферол/24 25(ОН) 0 /. Эти вещества являются биологически активными фор мами витамина D в организме человека.

Известен способ определения метаболитов витамина D в сыворотке крови путем добавления к образцу внутреннего стандарта, экстракции липидной фракции, хроматографической îчистки на колонке с силикагелем с после- 20 дующей элюцией и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Способ заключается в добавлении к 1 мл сыворотки меченого тритием стандарта ./3Н/ — 25-оксихолекальциферола и 25 последующей экстракции образца смесью хлороформ-метанол (2:1).

Затем экстракт очищают на микроколонке с силикагелем 0,5 2 см. Первую . фракцию элюируют 2 мл гексана, вторую фракцию 7 мл смеси хлороформ-гексан (3:2). Эти фракции отбрасывают.

Метаболит элюируют 7 мл смеси хлороформ-гексан (3:2). Образец упаривают и определяют концентрацию 25(OH)2

35 помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и изотопного анализа (1) .

Недостатком известного способа является его сложность и длительность. 40

Цель изобретения - упрощение способа. к

Указанная цель. достигается тем, что согласно способу определения метаболитов витамина 2 в сыворотке крови путем добавления к образцу внутреннего стандарта, экстракции липидной фракции, хроматографической очистки на колонке с силикагелем с последующей 3люцией и высокоэффек- 50 тивной жидкостной хроматографии, в качестве внутреннего стандарта ис" пользуют 17-ацетат эквиленола, а элюцию с колонки с силикагелем.проводят последовательно смесью гексен: 55 хлороформ в объемном соотношении

100:2, смесью гексан:хлороформ:уксусная кислота в соотношении 1.00:10:2, 039 2 хлороформом, смесью хлороформ: ацетон в соотношении 100:10 и смесью хлоро-. форм:ацетон:уксусная кислота в соотношении 50:50:1.

Пример. К 1 мл исследуемой сыворотки крови добавляют 25 мг

17-ацетат эквиленола в 100 мкл этанола и перемешивают в течение 10 мин.

Затем проводят экстракцию, добавляя

3,75 мл смеси гексан-изопропанол (1:2), 5 мин перемешивают и добавляют еще 1,25 мл гексана, и после тщательного перемешивания центрифугируют при 1000 об/мин 10 мин.

Органическую фазу отбирают, а остаток экстрагируют гексаном (1,25 мл х 2) .

Объединенный экстракт упаривают и переносят на микроколонку в гексане (0,25 мл,х 2). Предварительную очистку проводят на автоматическом процессоре образцов PREP-1 фирмы Du Pont

Jnctruments (США) с двенадцатиколончатым ротором с модифицированными стеклянными колонками ббх3 мм на силикагеле RSIL PREPSILICA с диаметром частиц 25-40 мкм фирмы Alltech

Associates (США) при скорости

1000 об/мин 4 мин. Первую фракцию элюируют 2 мл смеси гексан-хлороформ (100:2); вторую 2 мл смеси гексанхлороформ-уксусная кислота (100:

10:2); третью фракцию, содержащую

25(0H)D, элюируют 2 мл хлороформа, четвертую фракцию 2 мл смеси .хлороформ-ацетон (100:10), 1, 2 и 4 фракции отбрасывают. Пятую фракцию, содержащую 1,25(ОН) П и 24,25(ОН) П,5 элюируют 2 мл смеси хлороформ-ацетон-уксусная кислота (50: 50: 1) . Фракции, содержащие метаболиты, упаривают досуха под вакуумом при температуре не более

40 С, переносят в конические флаконы

0 объемом О, 3 мл, перерастворяют в 50 мкл смеси гексан.-изопропанол (90:10) и анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе 322 МР, AITEX (США) на колонке

u1trasphere Si (5 мкм 4 6х250 мм).

Детектирование при длине волны 265 нм.

Элюирующая система гексан-изопропанол (90:10). Расчет осуществляют по калибровочному графику. Для его построения определяют отношение высот пиков

25(OH) D . и 17-ацетат эквиленола при значениях 25 (ОН) D> равных 5 нг, 10 нг, 25 нг, 50 нг и 100 нг.. В данном примере отношение высоты. пика 25(OH)D.ó к высоте пика 17-ацетат эквиленола равно

1140039, По калибровочному графику определяют концентрацию 25(OH)D > равную

29 нг/мл.

Другие примеры определения концентрации 25(OH)D3 с помощью описанного метода представлены в таблице. (3

Высота пика 25(OH)D

Концентрация

25(OH)D5, определенная методом ВЖХ, мг/мл

Истинная концентрация

25(OH)D, мг/мл

Образец

10,5

15

21

26

31

50

50,5

60

70,5

80

По сравнению с известным предлагаемый способ обеспечивает упрощение, сокращение времени анализа, возможСоставитель Н. Гуляева

Редактор Т. Колб Техред А.Кикемезей

Корректор И. Муска

Заказ 256/34 Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Высота пика 17-ацетат эквкпенола

47 мм — — — — = .0,65

72 мм но c T ь мак сималь ной ав тома тиз ации и повьппение достоверности получаемых результатов..