Способ приготовления субстратно-инкубационной смеси для выявления изоферментов холинэстеразы

 

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СУБСТРАТНО-ИНКУБА1ЩОННОЙ СМЕСИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ИЗОФЕРМЕНТОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ, включающий смешивание 2,5%-ного раствора сульфата меди с 3, 75%-ным раствором хлорида магния и добавление 0,2 М раствора малеатного буфера с рН 7,3 и раствора ацетидтиохолиниодида или бутирилтиохолиниодида, отличающийся тем, что, с целью упрощения .и ускорения способа, порошкообразный ацетилтиохолиниодид или бутирилтиохолиниодид растворяют в буферном растворе, а к нему последовательно добавляют раствор хлорида магния и сульфата меди.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) 4(g1) С 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В

1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3641026/28-13 (22) 12.09.83 (46) 15.02.85. Бюл. Н- 6 (72) С.M.Òîìàðåâ и В.А.Сажин (71) Волгоградский государственный медицинский институт (53) 616.07(088.8) (56) 1. Бриткин А.П. -"Лабораторное дело", Р 10, 1977, с. 609-611 (прототип) . (54)(57) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СУБСТРАТНО-ИНКУБАЦИОННОЙ СМЕСИ ДЛЯ

ВЫЯВЛЕНИЯ ИЗОФЕРМЕНТОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ, включающий смешивание 2,57.-ного раствора сульфата меди с 3,75X-ным раствором хлорида магния и добавление 0,2 М раствора малеатного буфера с рН 7,3 и раствора ацетидтиохолиниодида или бутирилтиохолиниодида, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью упрощения .* ускорения способа, порошкообразный ацетилтиохолиниодид или бутирилтиохолиниодид растворяют в буферном растворе, а к нему последовательно добавляют раствор хлорида магния и сульфата меди.

1 11400

Изобретение относится к медицинской химии, а именно к способам выявления изоферментов холинэстеразы (КФ 3.1.1.8), и может быть использовано в медицине токсикологии гене 5 тике, молекулярной биологии и гистохимии.

Наиболее близким к предлагаемому. по технической сущности является способ приготовления субстратно-инкубационной смеси для выявления изоферментов холинэстеразы, предложенный А.П.Бресткиным согласно которому субстратно-инкубационная смесь готовится в указанной последовательности: к 0,2 мл 2,5Х-ного раствора сульфата меди добавляют 0,2 мл

3,75Х-ного раствора хлорида магния и

10,0 мл 0,2М раствора малеатного буфера с.рН 7,3, последним добавляется раствор субстрата — ацетилтиохолиниодида или бутирилтиохолиниодида. Раствор субстрата готовят. непосредственно перед использованием следующим образом 15 мг ацетилтиохолинйодида или 16,5 мг бутирилтиохолинйодида в виде порошка растворяют в 0,75 мл дистиллированной воды, добавляют 0,3 мл 2,5Х-ного раствора сульфата меди и образовавшийся осадок йодида одновалентной меди отделяют центрифугированием в течение

10 мин при 2000 об/мин, а затем раствор субстрата в виде надосадочной ! жидкости добавляют к предыдущим ком. 35 понентам смеси. Выявление изофермен- тов холинэстеразы происходит при инкубации гелей после электрофореза в субстратно-инкубационной смеси указанного состава в течение 20 мин при о 40

30 С путем осаждения образовавшегося в ходе ферментативной реакции гидролиза тиохолина ионами двухвалентной меди с последующей денситометрией гелей и ко- личественной оценкой выявленных зон (1) .

Недостатком известного способа является необходимость, как отдельной стадии, приготовления раствора субст1 рата -ацетилтиохолиниодида или бути-5О рилтиохолиниодида для выведения из процесса ионов йода путем осаждения

его в виде осадка йодида одновалентной меди, что влечет за собой необходимость использования оборудования 55 (центрифуги), затраты электроэнергии и увеличение времени приготовления субстратно-инкубационной смеси. Если

40 2 ионы йода не удалить из раствора субстрата, то при последующем смешивании его с приготовленной смесью предыдущих компонентов произойдет образование осадка йодида одновалентной меди в субстратно-инкубационной смеси, в результате чего она станет непригодной для выявления изоферментов холинэстеразы.

Цель изобретения — упрощение и ускорение способа приготовления субстратно-инкубационной .смеси для выявления изоферментов холинэстеразы с сохранением качества выявления путем изменения последовательности добавления компонентов при приготовлении смеси.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу приготовления субстратно-инкубационной смеси для выявления изоферментов холинэстеразы, включающему смешивание 2,5Х-ного раствора сульфата меди с 3,75Х-ным раствором хлорида магния и добавление

0,2 М раствора малеатного буфера с рН 7,3 и раствора ацетилтиохолиниодида или бутирилтиохолиниодида, порошкообразный ацетилтиохолиниодид или бутирилтиохолиниодид растворяют в буферном растворе, а к нему последовательно добавляют раствор хлорида магния и сульфата меди.

Растворение порошка субстрата в малеатном буфере создает субстратнобуферную среду, в которой комплексные растворимые соединения препятствуют образованию осадка.йодида одновалентной меди.

Способ осуществляют следующим образом. !

15 мг ацетилтиохолиниодида и

16,5 мг бутирилтиохолиниодида в виде порошка растворяют в 10,0мл

0,2 M раствора малеатного буфера с рН 7,3, потом добавляют 0,2 мл

3,75Х-ного раствора хлорида магния, последним добавляют 0,5 мл 2,5Х-ного раствора сульфата меди.

II р и м е р 1. (Расчет дан для проведения одного анализа, т.е. для инкубации одного .гелевого столбика).

По предлагаемому способу субстратноинкубационную смесь для выявления изофермеитов холинэстеразы в гелях готовят следующим образом.

Смешивают 50,0 мл 0,2 М раствора однозамещенного малеата натрия с

50,0 мл 0,2 М раствора едкого натра

Составитель Л. Артюшина

Техред А.Кикемезей Корректор И. Муска

Редактор Т ° Колб

Заказ 256/34

Тираж 897

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва,. Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 11400 и доводят до объема 200,0 мл дистиллированной водой, получая 0,2 M раствор малеатного буфера с рН 7,3. Затем 15 мг (5,2 ° 10 М) порошка ацетилтиохолиниодида растворяют в 5

10,0 мл 0,2 M раствора малеатного буфера с рН 7,3, а потом добавляют

0,2 мл 3,757-ного раствора (7,9 .10 М1хлорида магния, последним добавляют 0,5 мл 2,5Х-ного раствора 10 (7,8 10 M) сульфата меди. Субстратно-инкубационную смесь тщательно перемешивают.

Для выявления изоферментов сыво- . роточной холинэстеразы после проведения диск-электрофореза в 7,57.-ном полиакриламидном геле с использованием Tpttg =глицинового электродного буфера рН 8,3 гели преинкубируют в

0,2 М растворе малеатного буфера 20

30 мин при 30 С. Затем гели помещают

0 в субстратно-инкубационную смесь, приготовленную указанным способом и инкубируют 20 мин при 30 С. Выявлено ные зоны холинэстеразной активности в виде белых полос тиохолината двухвалентной меди денситометрируют в проходящем свете с последующей количественной оценкой полученных пиков кривой на денситограмме.

Пример 2. Смешивают 50,0 мл

0,2 M раствора однозамещенного малеата натрия с 50,0 мл 0,2 M раствора едкого натра и доводят до объема

200,0 мл дистиллированнои водой, 35 получая 0,2 М раствор малеатного буфера с рН 7,3 ° 16,5 мг (7,4 ° 10 M) порошка бутирилтиохолиниодида растворяют в 10,0 мл 0,2 М раствора малеатного буфера с рН 7,3, затем добавляют40

0,2 мл 3,75Х-ного раствора (7,9 10 М) . хлорида магния. Последним добавляют

0,5 мл 2,5 -ного раствора (7,8 10 М) 40 4 сульфата меди. Полученную субстратноинкубационную смесь тщательно перемешивают.

Последующие операции по выявлению изоферментов холинэстеразы производят описанным образом.

В результате применения предлагаемого способа по сравнению с прототипом упрощается и ускоряется процесс приготовления субстратно-инкубационной смеси для выявления изоферментов холинэстеразы, так как устраняется операция по приготовлению раствора субстрата и центрифугирование осадка, устраняется необ! ходимость эксплуатации лабораторного оборудования (центрифуги лаборатор ной), экономится электроэнергия, которая затрачивается в прототипе на операцию центрифугирования (100 ВА/

/ч при использовании лабораторной клинической центрифуги ОПн-3 в ходе приготовления субстратно-инкубационной смеси для одного анализа). Кроме того, за счет ликвидации операции по приготовлению раствора субстрата по прототипу с центрифугированием сокращается время, затрачиваемое на приготовление субстратно-инкубационной смеси (минимум на 30 мин при проведении одного анализа). Осадок, полученный в процессе центрифугирова- ния, с большими трудностями удаляется из пробирок для центрифугирования, что не дает возможности для повторного их использования и требует дополнительного расхода лабораторной посуды.

Качество выявленных изоферментов сывороточной холинэстеразы по предлагаемому способу не уступает качеству выявленных изоферментов по прототипу.