Способ определения протеолитической активности бактерий в биологических объектах

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ, предусмат1ривак щий осаждение белков путем добавления в исследуемый образец раствора трихлоруксусной кислоты, вцдержку, отделение белка от фильтрата фильтрованием, проведение цветной реакции путем добавления фёнольного реактива и щелочи к фильтрату, определение оптической плотности фильтрата и протеолитической активности по количеству тирозина, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения , осаждения белков осуществig ..::io:...v ляют 12%-ным раствором трихлоруксусной кислоты с последующим охлаждением , выдержку осуществляют, в течение 20 мин при 0-2 С, для проведения цветной реакции фенольный реактив и щелочь добавляют к 1-3 мл фильтрата, причем перед определением оптической плотности фильтрат фильтруют , а количество тирозина рассчитывают по формуле мг%. X Ю-а где X - содержание тирозина в 1 мл исследуемого образца; , b содержание тирозина в 1 мл фильтрата с трихлоруксусной (Л кислотой, V ; количество фильтрата (мл) а с трихлоруксусной кислотой, взятого в колбочку на 50 мл; кратность разведения образца п с трихлоруксусной кислотой, 1/10 - перевод из V в мг%. 2. Способ ПОП.1, отлича ющ и и с я тем, что при исследоваел U1 нии продуктов с вязкой консистенцией отделение белка от фильтрата осуществляют центрифугированием. &9 4i

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ((9) (! 1) А

4(51) G 01 N 33/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЪСТБУ и х = мгХ, 10. а

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3633931/28-13 (22) 19.08.83 (46/ 15.04.85. Бюл, У 14 (72) 3.Е. Грудзинская, А.К. Максимова и Н.К. Кудинова (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молочной промышленности (53) 637.127.6(088.8) (56) 1. Белозерский А.И. и др.

Практическое руководство по биохимии растений. М., "Советская наука", 1961, с. 264 (прототип). (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ В

БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ, предусматрива ощий осаждение белков путем добавления в исследуемый образец раствора трихлоруксусной кислоты, вЫдержку, отделение белка от фильтрата фильтрованием, проведение цветйой реакции путем добавления фенольного реактива и щелочи к фильтрату, определение оптической плотности фильтрата и протеолитической активности по количеству тирозина, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, осаждения белков осуществ- ляют 12Х-ным раствором трихлоруксусной кислоты с последующим охлаждением, выдержку осуществляют. в течение 20 мин при 0-2 С, для проведео ния цветной реакции фенольный реактив и щелочь добавляют к 1-3 мл фильтрата, причем перед определением оптической плотности фильтрат фильтруют, а количество тирозина рассчитывают по формуле где х - содержание тирозина в 1 мл исследуемого образца;, b — содержание тирозина в 1 мл фильтрата с трихлоруксусной кислОтОЙ» 41 а — количество фильтрата (мл) с трихлоруксусной кислотой, взятого в колбочку на 50 мл; и — кратность разведения образца с трихлоруксусной кислотой, 1/10 — перевод из / в мгХ.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что при исследовании продуктов с вязкой консистенцией отделение белка от фильтрата осуществляют центрифугированием, i 150534

1О средах, так как в этих средах содержится значительно больше нерасщепленных белков, которые являются балластом в исследуемом растворе и затрудняют количественное определение тирозина.

Цель изобретения — повышение точ30 ности определения.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу, предусматривающему осаждение белков путем добавления в исследуемый образец З5 раствора трихлоруксусной кислоты, выдержку, отделение белка от фильтрата фильтрованием, проведение цветной реакции путем добавления фенольного реактива и щелочи к фильтрату, 40 определение оптической плотности фильтрата и протеолитической активности по количеству тирозина, осаждения белков осуществляют 12Х-ным раствором трихлоруксусной кислоты с последующим охлаждением, выдержку осуществляют в течение 20 мин при

0-2 С для проведения, цветной реакции

0 фенольный реактив и щелочь добавляют к 1-3 мл фильтрата, причем перед определением оптической плотности фильтрат фильтруют, а количество тирозина рассчитывают по формуле

° n х = мг Х, 10- а

55 где х — содержание тирозина в 1 мл исследуемого образца;

Изобретение относится к молочной промьпиленности и может быть использовано для определения протеолитической активности молочнокислых бактерий по тирозину.

Известен способ определения протеолитической активности бактерий в биологических объектах, предусматривающий осаждение белков путем добавления в исследуемый образец раствора трихлоруксусной кислоты, выдержку, отделение белка от фильтрата фильтрованием, проведение цветной реакции путем добавления фенольного реактива и щелочи к фильтрату, определение оптической плотности фильтрата и протеолитической активности по количеству тирозина (1) .

Недостаток известного способа в том, что он не обеспечивает достаточной точности определения протео.— литической активности в молочных

b — содержание тирозина в 1 мл филътрата с трихлоуксусной (ТХУ) кислотой, ; а — количество (мл) фильтрата с трихлоруксусной кислотой, взятого в колбочку на 50 мл; п — кратность разведения образца с трихлоруксусной кислотой, 1/10 — перевод из (в мг X.

1(оме того, при исследовании продуктов с вязкой консистенцией отделение белка от фильтрата осуществляют центрифугированием.

В связи с тем, что в молоке и кисломолочных продуктах содержится повышенное количество белка в среднем до ЗХ, то для его осаждения при определении свободных аминокислот по тирозину в молочных образцах берут повьппенную концентрацию трихлоруксусной кислоты 12Х вместо 4Х по прототипу.

С целью повышения точности анализа более полного осаждения белка, введено увеличение выдержки. образцов с трихлоруксусной кислотой до 20 мин вместо 15 мин, вызвано снижением температуры охлаждения образцов с комнатной температуры до 0-2 С,,поскольку последняя снимает отрицательное действие повьппенного количества трихлоруксусной кислоты на образец.

Пример 1. Берут 10 мл исследуемого образца, добавляют 5 мл

12Х-ной трихлоруксусной кислоты, взбалтывают, охлаждают водой со льдом о до 1 С, в течение 20 мин выдерживают при этой температуре, затемфильтруют через бумажный складчатый фильтр. Для выявления аминокислот— триптофана, пистеина, тирозина, используют цветную реакцию с фенольным реактивом, разведенным дистиллированной водой в соотношении 1:2.

Для осуществления цветной реакции берут 3 мл исследуемого фильтрата в мерную колбу на 50 мл, добавляют к нему 10 мл раствора NaOH, 3 мл водного раствора фенольного резитива и дистиллированную воду до метки, тщательно взбалтывают и после установления цветной реакции фильтруют.

Через 5 мин определяют оптическую плотность. В данном случае оптическая плотность составляет 0,26, что соответствует 110 чистого тирозина на стандартной кривой. Подстановка исходных данных в формулу расчета

1150534

116 ° 1,5

10, 3 ™ О

1О

106 1,5 х= -= 159mX

10 1

Составитель H. Абрамова

Редактор С. Лисина Техред Л.Микеш Корректор Е. Сирохмай

Заказ 2134/33 Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 позволила определить количество тирозина, цистеина, триптофана в .пересчете на тироэин в 1 мл исследуемого образца х — 0 3 — 5,5 .мг .

110 ° 1,5 5

Метод точен, так как по нему определяется количество свободных аминокислот по стандартной кривой, построенной по растворам с известным содержанием химически чистого тирозина. Процент ошибки в зоне точности не превышает 2,5-57, что приемлемо для исследования биологических обьектов.

Пример 2. Берут 10 мл исследуемого вязкого образца, добавляют 5 мл 127-ной трихлоруксусной о кислоты, охлаждают до 2 С, в тече- . ние 20 мин выдерживают при этой

20 температуре, отделяют белок центрифугированием, 2 ип фильтрата вносят в мерную колбочку на 50 мл, добавляют 10 мл 1/2 н. раствора NaOH, 3 мл фенольного реактива и доливают дистиллированную воду до метки, взбалтывают, фильтруют, и через

10 мин определяют на ФЭКе. Оптическая плотность составляет О, 15, что соответствует 116 на стандартной кривой .

Подстановка исходных данных в формулу пересчета позволила определить количество тирозина, пистина, триптофена в пересчете на тирозин в 1 мл исследуемого образца

Пример 3. Берут 10 мл исследуемого образца, добавляют 5 мл

127-ной трихлоруксусной кислоты, охлаждают до 2 С, в течение 20 мин отделяют белок через бумажный фильтр, 1 мп фильтрата вносят в колбочку на 50 мл, добавляют 10 мл

1/2 н. раствора NaOH 3 мл фенольного реактива и доливают дистиллированную воду до метки, взбалтывают, фильтруют и через 10 мин определяют йа ФЭКе. Оптическая плотность соответствует О, 12, что составляет

106 / на стандартной кривой.. Подстановка исходных данных в расчетную формулу позволяет определить аминокислоты в 1 мл исследуемого образца с точностью 95-987.