Способ определения динамики таксиса анизотропных по форме микроорганизмов

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИНАМИКИ ТАКСИСА АНИЗОТРОПНЫХ ПО ФОРМЕ МИКРООРГАНИЗМОВ , включающий введение градиента раздражителя в суЬпензию бактерий, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и ускорения способа, после введения градиента раздражителя спектрофотометрическн регистрируют ориентацию клеток.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (39) (!1) 4р<1 С 12 N 1/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННИЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3585956/28-13 (22) 28.04.83 (46) 07.05.85. Бюл, Н 17 .(72) В.Н. Врезгуйов и Л.10. Завальский (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (53) 576.8..093. 1(088.8) (56) 1. "3. Gen. Gen.", 1973, 74, 7 7-91.

2. "Nature New Biol;", 1972, 236, 120-123. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИНАМИКИ

ТАКСИСА АНИЗОТРОПНЫХ ПО ФОРИЕ ИИКРООРГАНИЗИОВ, включа10щий введение градиента раздражителя в суспензию бактерий, отличающийся тем, что, .с целью повьаиения чувствительности и ускорения способа, после введения градиента раздранителя спектрофотометрически регистрируют ориентацию клеток.

11S4328

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для определения динамики анизотропных по форме микроорганизмов в применениях к микробиологической промьш ленности, а также к медицинским исследованиям.

Предлагаемый способ позволяет проводить оперативное измерение таксиса анизотропных по форме микроор- 16

1 ганизмов, а следовательно, определять наличие подвижности у бактериальных клеток и оценивать динамику их поведения при воздействии градиента раздражителя. 15

Известен .способ определения таксиса микроорганизмов с помощью капилляра. Сущность способа заключается в том, что капилляр с раздражителем (в частности, с хемоэффекто- 39 ром — аттрактантом или репеллентом) открытым концом (противоположный конец капилляра запаян) вводится в

0-образную трубку, находящуюся на предметном столике микроскопа. Через 25 час капилляр извлекается из камеры, его содержимое выдувается в пробирку с питательной средой, и далее содержимое пробирки выливается в чашку с питательной средой, после чего подсчитывается число колоний.

Время измерения составляет около суток (1) . . К недостаткам способа относится плохая воспроизводимость результа35 тов, обусловленная низкими точностями микробиологических операций (посевы, подсчеты колоний и т.д.) и невозможностью создания и изменения градиентов раздражителя в соответ.ствии с требованиями эксперимента.

ig

<Воспроизводимость метода составляет

+15Õ и позволяет определить наличие таксиеа к определенным раздражителям.

Этот способ не может быть применен . 45 для изучения быстрой динамики процессов таксиса, так как точность визуальных наблюдений в капилляре черезвычайно низка получение результатов требует продолжительных затрат на проведение эксперимента.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ опреде-55 ления таксиса по слежению за образованием полосы бактериальной популяции (2) .

Для осуществления способа разработана установка, в которой испбльзован принцип определения числа бактерий по интенсивности светорассеяния в направлении, перпендикулярном падающему лучу лазера. Указанный принцип справедлив при концентрации бактерий ниже 10 клеток/мл. Задача за7 ключается в определении изменений мигрирующей полосы бактерий после ее образования. В конкретном эксперименте по изучению таксиса Ба1шопе11а typhimurium перераспределение клеточной концентрации регистрируется через 15 мин после наслоения градиента хемоэффектора на равномерно распределенные по кювете бактерии.

Однако вклад в интегральное светорассеяние обуславливается не только клетками, обладающими таксисом, а всеми клетками, имеющимися в суспензии. Кроме того, способ обладает низкой чувствительностью, так как регистрация эффекта изменения светорассеяния в ограниченном телесном угле при малых концентрациях клеток не позволяет получить высокого отноше.— ния сигнал/шум.

Целью изобретения является повышение чувствительности и ускорение способа.

Поставленная цель достигается тем, что при способе определения динамики таксиса анизотропных по форме микроорганизмов, включающем введение градиента раздражителя в суспензии бактерий, после введения градиента раздражителя спектрофотометрически регистрируют ориентацию клеток.

Изменение оптической плотности обуславливается изменением светорассеяния за счет обнаруженного явления ориентации микроорганизмов при положительном или отрицательном таксисе в градиентах раздражителя.

Указанный эффект, заключающийся в изменении светорассеяния из-эа ориентации клеток, наблюдается только для клеток, обладающих анизотропной формой {палочки, цилиндры, элпипсоиды вращения и т.д.). Для клеток абсолютно сферической формы этот эффект не имеет места. Следует отметить, что большинство подвижных клеток, обладающих эффектом таксиса, имеет анизотропную форму.

Поскольку ориентация клеток в градиенте раздражителя осуществляется

1154328

ВНИИ Заказ 3960

Тмоаж 525 Подписное

Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул.Проектная,4 быстро (менее чем за 1 с), предложен-: ный способ позволяет определять таксис микроорганизмов прежде, чем начнут появляться концентрационные изменения, и следить за динамикой f процесса возбуждения клеток. При этом указанные изменения вызваны только клетками, обладающими собственной физиологической подвижностью в градиенте раздражителя. 10

Возможно применение различных методик регистрации, в том числе и регистрации изменений оптической плотности вдоль падающего луча, т.е. при о углах рассеяния близких к 0

Расчет и проведенные эксперименты показывают, что изменение оптической плотности при измерениях вдоль падающего луча света за счет ориентации клеток в процессе таксиса составляет 5-10Х от оптической плотности суспензии. При концентрации клеток в суспензии порядка 10 клеток/мл (при такой концентрации обычно проводят эксперименты) эта величина ре- 2S гистрируется обычными фотометрическими системами с соотношением сигнал/шум не хуже t00.

Измеряемыми характеристиками являются: форма кривой изменения оптической плотности суспензии микроорганизмов во время воздействия градиента раздражителя и ее зависимость от начальной, интенсивности (концентрации); амплитудное значение эффек35 та изменения оптической плотности и характеристика этой величины при различных интенсивностях (концентрациях) раздражителя; .форма кривой процесса адаптации микроорганизмов (обратное изменение оптической плотности) к градиенту- раздражителя при его различных начальных интенсивностях (концентрациях).

Пример, В эксперименте определялось наличие хемотаксиса у бактерий Escherichi.a col i К-12, имеющих форму вытянутого эллипсоида вращения. Суспензия бактерий при оптичесS0 кой плотности 0,3 помещалась в оптическую кювету, в верхней части которой находилась дополнительная кювета с,мембранным фильтром. Оптическая кювета облучалась лучом фотометрической системы (ФЭК-56M), с помощью

f$ которой осуществлялась регистрация (с помощью ЭПП-09} изменений оптического сигнала. Инжекция хемоэффектора выполнялась с помощью микропипетки.

При инжекции хемоэффектора в дополнительную кювету он под действием процесса диффузии проникал в пространство оптической кюветы и суспензию бактерий. За счет диффузии и се- . диментации создавался градиент хемоэффектора в суспензии бактерий. Записывались изменения оптического сигнала при инжекции 20.мкл 10,М Ь-серийа и при инжекции 20 мкл 20Х этилового спирта. По оси ординат откладывали уменьшение оптической плотности

0 суспензии бактерий Е. coli К-12, па оси абсцисс — время. С учетом времени диффузии и образования градиента хемоэффекторов время отклика оггтического сигнала не превышает одной минуты.

Инжекция 20 мкл буфера (того же состава, как в кювете) не вызвала изменений оптической плотности, также как и воздействие указанных хемоэффекторов на клетки Е. -coli., не имеющие жгутиков.

Из записей можно сделать следующие выводы:

1. Хемотаксис у исследуемых бактерий Е. coli К-12 есть, а следовательно, эти клетки обладают подвижностью.

2. Формы кривых изменения оптической плотности во время действия градиентов различных раздражителей и в период их адаптации к этим раздражителям отличаются.

3. Соотношение сигнал/шум в приведенных записях не хуже 100.

Таким образом, предлагаемый способ позволит оперативно определять таксис бактериалъных клеток и регистрировать его динамику, а следовательно, может быть полезен для быстрого определения подвижности микроорганизмов, идентификации соответствующих рецепторов (например, хемореценторов при хемотаксисе, наличие двигательного шока при фототаксисе и т.д.), исследования вопросов работы регуляторной системы бактерий и подбора раздражителей при направленном разделении клеток с использованием явления хемотаксиса.