Штамм bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis имп 1140 n цмпм-в2711 продуцент -экзотоксина

 

Штамм Bacillus fhuringiensis subsp fhuringiensis ИПМ 1140 N ЦМПМ-В 2711 (коллекция Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов) - продуцент b-экзотоксина.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый штамм Bac. thuringiensis, используемый для производства энтомопатогенного бактериального препарата битоксибациллина. В настоящее время в микробиологической промышленности для производства энтомопатогенных бакпрепаратов используют различные штаммы Bacillus thuringiensis, выделенные из погибших насекомых и отобранных в процессе селекции [1] Эти штаммы продуцируют как эндотоксин, так и экзотоксин. Известен также штамм β 202, на основе которого получают препарат битоксибациллин [2] Однако этот штамм относительно мало продуктивен и характеризуется нестабильным токсинообразованием. Целью изобретения является получение штамма Bac. thuringiensis, обладающего стабильным и высоким уровнем токсинообразования. Для достижения цели предлагается штамм Bacillus thuringiensis subsp thuringiensis ИПМ 1140 N ЦМПМ-В2711 (коллекции всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов)-продуцент N экзотоксина. Полученный штамм N ЦМПМ-В2711 имеет следующую морфологическую характеристику: на МПА колонии серовато-белые, с ризоидными краями. Поверхность колоний шероховатая, структура крупнозернистая, трехсуточная культура имеет типичную R-форму колоний с диаметром 29 мм. Величина клеток в экспоненциальной фазе развития на МПА 4 6 мкм. Преобладающая форма - палочковидная. На жидких питательных средах типа МПБ, ДПС встречаются в виде длинных подвижных цепей. В стадии стационарного роста и развития образует овальные опоры размером 2х1,5 мкм и белковые кристаллы в виде ромба с нечеткими краями. Перитрихи. По H антигену относится к 1 серотипу. Физиолого-биохимические признаки. Органическая среда для размножения - МПА, в концентрации 2% На МПБ помутнение, образование вуали. Молоко лакмусовое: пептонизация, с последующей коагуляцией. На молочном агаре - зоны лизиса 12 14 мм через 24 ч. Агар с желатиной воронкообразное разжижение. Агар-казеин слабое просветление вокруг колоний, что свидетельствует о незначительной протеолитической активности штамма. Для производства энтомопатогенных бактериальных препаратов используется дрожжеполисахаридная среда. Интенсивный рост штамма на данной среде наблюдается к 17 ч культивирования при 28 30^oC. Спорообразование отмечается на 26 28 ч и заканчивается к 48 ч. Процент свободных спор к этому времени составляет 95. Титр жизнеспособных спор в конце ферментации на ДПС составляет 2,5 0,6 млрд/мл. Максимальный титр при поверхностном высеве 3,0 - 3,2 млрд/мл. Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает: глюкозу, мальтозу, сахарозу, маннозу, крахмал. Слабо усваивает: рамнозу, арабинозу, ксилозу, целлобиозу, лактозу не усваивает. Активен по отношению к эскулину. Не образует ацетилметилкарбинол. Спонтанное вышепение, фаза отсутствует. Штамм обладает токсичностью для личиной комнатной мухи, гусениц 2 3 возрастов капустной совки, личиной колорадского жука, а также овоцидным действием против мельничной огневки. Результаты сравнительного исследования продуктивности и вирулентности производственного и предлагаемого штаммов представлены в примерах 1 3. Пример 1. Продуктивность штаммов определяют в условиях глубинного культивирования в качалочных колбах емкостью 750 мл с 75 мл дрожжеполисахаридной среды (240 об/мин, 28^oC, 48 ч, аэрации 1:1) на протяжении 10 опытов в 3 повторностях. Число жизнеспособных спор определяют методом глубинного титрования на СПА. Полученные данные, представленные в табл. 1, показывают, что штамм ИПМ 1140 имеет титр, превышающий титр штамма 202 на 20 25% (2,0±0,5 млрд/мл для 202 штамма и 2,5±0,6 для штамма ИПМ 1140). Таким образом, предлагаемый штамм является более продуктивным чем, используемый в настоящее время для производства битоксибациллина промышленный штамм 202. Пример 2. Полученный препарат экзотоксина исследуют в отношении эффективности действия на пчелиную огневку и домашнюю муху. Для этого в одинаковых условиях параллельно проводят культивирование штаммов ИПМ-1140 и 202-го промышленного на 3 питательных средах: ДПС, Кантвелла, Баржак в течение 48 ч, после чего культуральную жидкость освобождают центрифугированием от спор и кристаллов, концентрируют упариванием при 70^oC в 5 10 раз, автоклавируют, используют как технический препарат экзотоксина. Инсектицидную активность экзотоксина определяют на 2 специфических для экзотоксина тест-объектах: пчелиной огневке, домашней мухе. Биотестирование и обработку результатов проводят по ГОСТу ТУ-59-05-01-78 для битоксибациллина. Количество экзотоксина на личинах пчелиной огневки определяют методом инъецирования в гемоцель 5 мкл экзотоксина в разведениях. Состав сред, используемых для выращивания штаммов. ДПС, БВК 3,0; кукурузная мука 1,5. Среда Кантвелла, KH₂PO₄ 0,5; K₂HPO₄ 0,5; MgSO₄ 0,005; FeSO₄ 0,001; цитрат натрия 0,3; (NH₄)₂SO₄ 0,05; пептон 1; pH 7,2. Среда Баржак, г/л: KH₂PO₄ 8; MgSO₄ 0,123; MnSO₄ 0,02; ZnSO₄ 0,014; CaCl₂ 0,183; пептон 7,5. Инсектицидная активность экзотоксина штамма ИПМ-1140 в 4 раза выше чем у штамма 202 при инъекцировании (на средах ДПС и Баржак) и в 1,6 раза на среде Кантвелла. В табл. 2 приводятся данные по инсектицидной активности препарата экзотоксина по отношению к домашней мухе при скармливании, т.е. через желудочно-кишечный тракт, что несомненно вызывает некоторую инактивацию токсина. Как видно из данных табл.2, экзотоксин штамма ИПМ 1140 в 2 раза токсичнее чем контрольного штамма 202. Следовательно, предлагаемый штамм является более продуктивным по экзотоксину, что обеспечивает его конкурентноспособность в борьбе с колорадским жуком. Гибель колорадского жука от экзотоксина в разведении 1/4 на третьи сутки 46 50% для штамма ИПМ 1140 и 17 20% для 202 штамма. Гибель его от нативного токсина соответственно 100 80% Пример 3. В связи с тем, что предлагаемый штамм содержит помимо экзотоксина эндотоксин для сравнения спорово-кристаллических комплексов, свободных от экзотоксина, штаммы 202 и ИПМ 1140 выращивают на кукурузно-мелассовой среде до полного спорообразования. Отмывают от экзотоксина, делают различные разведения споровой взвеси и скармливают ее гусеницам капустной совки или обрабатывают яйца мельничной огневки (овоцидный эффект). Через 5 7 дней учитывают гибель насекомых. ЛК₅₀ для 202 штамма 10,64·10⁸ и 26,4·10⁷ спор/мл и 3,17·10⁸ и 3,69·10⁷ для ИПМ-1140. Таким образом, предлагаемый штамм отличается большей инсектицидной активностью спорово-кристаллического комплекса против таких вредителей сельскохозяйственных растений, как капустная совка и мельничная огневка.

Формула изобретения

Штамм Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis ИПМ 1140 N ЦМПМ-В2711 (коллекция Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов) продуцент b-экзотоксина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2