Способ определения вида бактериальной инфекции

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДА БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ, включакя ий вьщеление бактериальных клеток из патологического материала больных, отличающиеся тем, что, с целью повышения точно 1ти способа и сокращения времени исследования, дополнительно из крови того же больного выделяют гранулоциты и иссле- . дуют нх хемотаксическую активность по отношению к выделенный япвьм бактериям и при индексе хемотаксиса меньше одной условной единицы определяют вид бактериальной инфекции.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

И

РЕСПУБЛИК

<л>он

44 А

4(у) А 61 В 10/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСН0МУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3520102/28-13 (22) 10.12.82 (46) Z3.05.85. Бюл. В 19 (72) Л.Я. Эберт, А.В. Чукичев, А.В. Зурочка, С.И. Марачев и Л.Б. Новокрещенов (71) Челябинский медицинский инсти-, тут (53) 615.375 (088.8) (56) Меньшиков Ю.I0. Бактериологичес кие исследования при гнойно-воспалительных процессах мягких тканей. — "Лабораторное дело", 1980, У 2,. с. 67-71. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДА

БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ, включающий выделение бактериальных клеток иэ патологического материала больных, о т л и ч а ю щ и .й с я тем, что, с целью повышения точности способа и сокращения времени-исследования, дополнительно из крови того ае больного выделяют гракулоцнтм и иссле- . дуют их хемотаксическую активность .но отношению к ввщеленнвв вивмк бактериям и при индексе хемотаксиса меньше одной условной единицы определяют вид бактериальной инфекции.

1 11

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии и иммунологии.

Цель изобретения - повышение точности определения вида бактериаль-, ной инфекции и сокращение времени исследования.

Способ осуществляют следующим образом.

У больного забирают 10 мл венозкой крови и помещают в силикониэированные пробирки, содержащие 250 ЕД гепарика (25 ЕД/мл). Осаждение эритроцитов производят путем отстаивания крови при 37 С в течение 1 ч после добавления 1 мл 10%-ного раствора желатины. В период осаждения эритроцитов готовят агарозкый гель.

Приготовленный агарозный гель раз ливают в пластмассовые лабораторные чашки Петри для однократного пользования, на дне которых находятся покровные стекла размером 24 " 24 мм.

Объем агарозного геля на одну чашку ранен 3 мл..Для формирования лунок в агарозком геле применяется стандартный штамп, представляющий собой металлический (латунный) диск, диаметром 40 мм и высотой 15 мм, на нижней поверхности которого распо,лагаются 9 полых латунных стержней с наружным диаметром 2,4 мм. Стержни располагаются по строго перпендикулярно перекрещивающимся линиям.

При этом один из стержней находится в точке перекрещиваниялиний, а остальные стержни попарно располагаются на этих линиях. Расстояние между стержнямн 2,4 мм. Высота стержней должка быть строго одинакова и не менее 1 см.

После приготовления чашек с агарозным гелем последние помещают в эксикатор с углекнслым газом. Зкси,катор с чашечками выдерживают до появления оранжевой окраски агарозного геля. По окончании данной манипуляции чашки с агарозкым гелем считаются готовыми для определения хемотаксиса гранулоцитов под агарозой.

Для получения взвеси лейкоцитов образовавшееся после осаждения зрит роцитов кольцо сыворотки осторожно удаляют из пробирки и наслаивают ка 2 мл градиента плотности фнколл-верографик (d = 1,077). После

56644 2

1а

ЗО

50 центрифугирования при 1500 об/мин (400 8) в течение 20 мин образовавшиеся слой плазмы, слой фиколл-верографина и между ними слой мононуклеаров (лимфоциты и моноциты) удаляют. К оставшемуся на дне пробирки осадку, содержащему гранулоциты и примесь эритроцитов, добавляют 8 мл

0,83%-ного раствора хлористого аммония с целью разрушения эритроцитов.

После ресуспекдирования полученную взвесь гранулоцитов инкубируют в течение 10 мик при 0 С. Далее гракулоциты отделяют от раствора хлорйстого аммония и элементов разрушенных эритроцитов путем трехкрат-. ного промывания s растворе Хенкса и центрифугированЪя при 1500 об!мин в течение 10 мик. Отмытые грануло- . циты разводят в среде 199 до концентрации 10 клеток/мл.

В качестве хемоатрактантов используют взвесь чистых живых культур бактерий концентрации

10 бактерий/мл. Взвеси бактерий в получаются путей смыва стерильной средой 199 суточных культур. Концентрация .бактерий определяется по стандарту мутности.

После приготовления всех исходных ингредиентов (взвеси гранулоцитов, чашек с агароэным гелем, бактериальных хемоатрактантов) и центральную .лунку вносят пастеровской пипеткой 0,02 мл среды 199.

В средние лунки помещается суспензия гранулоцитов, а в крайние— различные бактериальные хемоатрактанты. При этом ка одной чашке с агароэным гелем становится возможным изучение хемотаксиса одновременно к четырем предполагаемьм видам возбудителей инфекции.

Завершив описанный этап, эксикатор с чашечками и добавленным в него углекислым газом помещают в термостат на 3 ч при 37 С. По окончании этого срока для фиксации клеток к стеклу чашки заливают 47%-ным раствором формалина илк метиловым спиртом. После 30-минутной фиксации слой агароэного геля удаляют и стекло промывают s проточной воде.

Учет результатов осуществляют под микроскопом (увеличение 56) е помощью окулярного микрометра. Для этого измеряют две эоны миграции гранулоцитов: в сторону бактериальf56644 4

ВНИИПИ Заказ 3215/2 Тираж 722 Подписное

Филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная, 4

3 ного хемоатрактанта (А) и в сторону среды 199 (В). Индекс хемотаксиса

А (ИХ) вычисляется по формуле ИХ = — .

В

Интерпретация результата исследования осуществляется следующим образом, если индекс хемотаксиса гранулоцитов к изучаемому бактериальному хемоатрактанту меньше усл.ед. то это указывает на наличие соответственной бактериальной инфекции у обследуемого больного.

Общая продолжительность исследования 5-6 ч.

Пример. Больная Т.Н,, 8 лет, госпитализирована в клинику детской хирургии через 7 сут с момента заболевания с диагнозом: острый гематогенный остеомиелит правой подвздошной кости, септикопиемическая форма, реактивный артрит правого тазобедренного сустава, двусторонняя септическая пневмония, токсический миохардит. При поступлении у больной определен индекс хемотаксиса гранулоцитов к пяти различным бактериальным хемоатрактантам (золотистый стафилококк, синегнойная палочка, кишечная палочка, протей, стрептококк). При этом обнаружено снижение индекса хемотаксиса гранулоцитов к золотистому стафилококку до

0,3 усл.ед., в то время как к другим хемоатрактантам индекс был больше усл.ед. Заключение: возбудителем гнойно-воспалительного заболевания у ребенка является золотистый стафилококк.

Одновременно с исследованием хемотаксиса гракулоцитов проводилось бактериологическое исследование крови и экссудата из гнойного очага. В результате бактериологического исследования на 4-е сутки из гнойного очага выделен золотистый стафилококк. Аналогичный результат .получен на 10-е сутки при исследовании гемокультуры. Таким образом, результаты исследования, полученные с помощью предлагаемого способа, были проконтролированы и подтверждены известными бактериологическими способами.

Для диагностики вида бактериальной инфекции способ был применен

3S

50 у 12 больных с острьв и гнойными хирургическими заболеваниями (острьй г матогенный остеомиелит, острая гнойная деструктивная пневмония, осложненная абсцессами легкого, пиопкевмотораксом, пиотораксом, флег мона мягких тканей) . При исследовании индекса хемотаксиса граиулоцитов больных к различным бактериальным хемоатрактантам (золотистый стафилококк, кишечная палочка, синегнойная палочка, протей, стрептококк) было обнаружено, что у девяти больных индекс хемотаксиса к золотистому стафилококку бып меньше

1 усл.ед., у двух больных - к синегнойной палочке, а у одного больного наблюдалось одновременное сникение индекса хемотаксиса к кишечкой палочке и стрептококку. При бактериологическом контроле у семи больных был выделен стафилококк, у двух — синегнойная палочка,у одного больного — кишечная палочка и стрептопокк. У двух больных при посеве гноя роста микрофлоры не было получено. Однако изучение хемотаксиса. гранулоцитов у этих больных к стафилококку выявило.значительное снижение индекса, соответственно

0,33 и 0,46 усл.ед. В то же время, индекс хемотакскса к кишечной палочке, синегкойной палочке, протею и стрептококку у них превышал

1 усл.ед. Учитывая эти данные, можно говорить о наличии стафилококковой инфекции у этих больных, несмотря на отрицательный результат бактериологического исследования.

Таким образом, способ позволяет сократить сроки определения вида бактериальной инфекции в 4-40 раз, что дает воэможность своевременно назначить больным этиологически обоснованную иммунофаго- и химиотерапию, повысить точность исследования с 83 до 100Х а также более точно диагностировать возможные ассоциации возбудителей у больного (наличие одновременно двух и более возбудителей инфекции у больного), уменьшить весь объем диагностических мероприятий путем проведения целенаправленных бактериологическиМ исследований.