Способ получения стимулятора из селезенки млекопитающих

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА ИЗ СЕЛЕЗЕНКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, вклюВСЕСОЮЗНАЯ 4 л. ;:(. , S15..-;4 ., чающий обработку органа ацетоном, его измельчение, получение надосадочной жидкости, обработку ее ацетоном с последующим отделением осадка, его экстракцией и лиофилизацией, о т л и Ч:а ю щ и ис я тем, что, с целью повышения иммуностимулирующей активности, измельченную селезенку экстрагируют в 3%-ном растворе уксусной кислоты при рН 3,0-4,0, в присутствии хлористого цинка, а осадок, полученный после обработки экстракта ацетоном, экстрагируют водой в присутствии зксусной кислоты при рН 6,0-7,0 с последующим фипьтрованием и лиофштизацией. 5

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

4(5 ) А 61 К 35/28

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

М АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОсудАРстВенный номитет сссР

flo делАм изоБРетений и ОтнРытий (21) 3646122/28«13 (22) 03,06,83 (46) 30.05 85. Бюл. У 20 (72) В.Х.Хавинсон, В.Г.Морозов, Н.Д.Сидорова, В.Л.Константинов, О.В.Чайка и Й.Ф.Говорова (71) Ленинградское производственное объединение мясной промышленности им. C.Ì.Êèðîâà (53) 615.361.41 (088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

11 839090,кл. А 61 К 35/28,1979 (про.тотип). (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА

ИЗ СЕЛЕЗЕНКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, включающий обработку органа ацетоном, его измельчение, получение надосадоч" ной жидкости, обработку ее ацетоном с последующим отделением осадка, его экстракцией и лиофилизацией, о т л и ч:а ю шийся тем, что, с целью повышения иммуностимулирующей активности, измельченную селезенку экстрагируют в 3Х-ном растворе уксусной кислоты при рН 3,0-4 ° О, в присутствии хлористого цинка, а осадок, полученный после обработки экстракта ацетоном, экстрагируют водой в присутствии уксусной кислоты при рН 6,0-7,0 с последующим фильтрованием и лиофилизацией.

1158201

Изобретение относится к медицинской промышленности и может быть использовано для иммуностимуляции организма.

Цель изобретения — повышение иммуностимулирующей активности.

Цель достигается тем, что согласно способу получения стимулятора из селезенки млекопитающих, включающему обработку органа ацетоном, его из- 1О мельчение, получение надосадочной жидкости, обработку ее ацетоном с последующим отделением осадка, его экстракцией и лиофилизацией, измельченную селезенку экстрагируют в ЗХ- 1S ном растворе уксусной кислоты при рН = 3,0-4,0 с добавлением хлористого цинка, а осадок, полученный после обработки экстракта ацетоном, экстрагируют водой в присутствии уксусной 20 кислоты при рН 6,0-7,0 с последующим фильтрованием и лиофилизацией.

Переработка путем зкстрагирования измельченной селезенки в 37-ном растворе уксусной кислоты позволяет произвести гидролиз крупных белков . и других высокомолекулярных соединений, что способствует лучшей очист" ке и устранению пирогенности. Добав- ление хлористого цинка способствует полному выделению из селезенки конечного продукта и лучшему осаждению его ацетоном. Экстракция осадка в воде при определенном рН (экстрагент — раствор уксусной кислоты) способствует растворению в воде наиболее активных веществ и позволяет отделить от них нерастворимые балластные вещества путем фильтрации, Отклонение от заданных пределов кис40 лотности приводит к потере активного вещества.

Существующие известные решения не имеют свойств, присущих пред« 4> ложеиному. Концентрация спиртовой фракции, концентрация диализата приводит к разрушению специфического начала вещества в результате гидро лиза. Предложенное в известных способах отделение балластных веществ происходит за длительный период и малоэффективно. Отделение сопутствую щих веществ ведет к потерям. Способ-, прототип, взятый за базовый объект, 55 позволяет получить вещество, которое ингибирует синтез ДНК, но не оказывает стимулирующего действия на лимфоциты и активные Т-лимфоциты селезенки.

Пример 1, Берут селезенку крупного рогатого скота, промывают водой. Селезенку помещают в ацетон, берут 1 часть селезенки и 1О частей о ацетона с температурой -5 С. Через

24 ч ацетон сливают, а селезенку

0,5 кг измельчают и помещают в реактор с мешалкой. Измельченную селезенку заливают 5 л раствора 3Х-ной уксусной кислоты при pH = 3,0, добавляют 0,005 кг хлористого цинка и экстрагируют 36 ч, перемешивая ч через каждые 8 ч. По окончании экстракции субстрата сливают и цент. рифугируют 15 мин со скоростью

3000 об/мин, надосадочную жидкость декантируют, к ней добавляют 6 частей ацетона на 1 часть жидкости, перемешивают и формуют осадок 20 ч.

Выпавший осадок высушивают на фильтре, измельчают и растворяют 0,01 кг в 0,5 л воды с добавлением уксусной кислоты до рН=7,0. В течение 2 ч непрерывно перемешивают и удаляют балластные вещества путем фильтрации. Полученный раствор стерильно фильтруют через пластины EKS, разливают во флаконы так, чтобы в каждом содержалось 10 мг вещества и лиофилизируют, Выход активного вещества 0,005 кг. .Пример 2, Берут селезенку животных, промывают водой и ацетоном, помещают 1 часть селезенки в

10 частей ацетона с температурой о

-5 С. Через 24 ч ацетон сливают.

10 кг селезенки измельчают на волч« ке, помещают в реактор и заливают

100 л раствора уксусной кислоты до рН = 4,0, добавляют 0,1 кг хлористого цинка и экстрагируют 36 ч, перемешивая непрерывно по часу через каждые 8 ч. По окончании экстракции субстрат сливают и центрифугируют

l5 мин со скоростью 3000 об/мин, надосадочную жидкость декантируют, к ней добавляют 6 частей ацетона на

1 часть жидкости, перемешивают и фор. мируют осадок 20 ч, Выпавший осадок высушивают на фильтре, измельчают и растворяют 0,2 кг осадка в 10 л воды с добавлением уксусной кислоты до рН = 6,0. В течение 2 ч перемешивают и удаляют балластные вещества фильтрацией. Отфильтрованный раствор. стерильно фильтруют через пластины

1l"R201 циты являются иммунокомпетентными клетками.

Установлено, что введение вещества, полученного из селезенки по пред. ложенному способу приводит к значительному увеличению лимфоцитов и

1! и активных T-лимфоцитов в селезенке.

Все остальные вещества, полученные известными способами подобной актив0 ностью не обладали.

При физико-химическом анализе выделенного из селезенки вещества устанбвлено, что оно представляет собой комплекс полипептидов. Изучение токсичности и аллергизирующих свойств выделенного вещества на животных показало, что препарат иэ селезенки не обладает в терапевтических дозах подобной активностью. Это указывает на перспективность препарата иэ селезенки для применения. в медицинс» кой практике.

Эксперименты, проведенные на животных, указывают на тканеспецифическую стимуляцию иммунокомпетентных клеток в селезенке под воздействием .вещества, выделенного из этого же органа, Это явление может быть использовано для создания лекарственного препарата с целью стимуляции активности клеток селезенки, где, как известно, происходит образование и функционирование антителообразующих клеток после появления антигенов в организме, Известно, что применение различных цитостатических средств, ионизирующей радиации, глюкокортикоидов приводит к резкому подавлению иммуногенеэа. Поэтому применение в этих случаях препарата иэ селезенки является целесообразным и полезным.

ЕК5, разливают во 4ичаконы так, чтобы в каждом содержалось 10 мг вещества и лиофилиэируют, Получают О,) кг активного вещества из 10 кг сырья.

Пример 3. Берут свиную селезенку, промывают, помещают в ацетон с температурой -5 C выдерживао ют сутки, сливают ацетон. Берут кг селезенки, измельчают и экстрагируют в 10 л З -ного раствора уксусной кис- 1 лоты при pH = 3,5. Добавляют 0,01 кг хлористого цинка, экстрагируют 36 ч попеременно перемешивая. По окончании экстракции субстрат сливают, центрифугируют, надосадочную жидкость1 декантируют,к ней добавляют 6 частей ацетона на 1 часть жидкости,перемешивают и формируют осадок за 20 ч,Полученный осадок высушивают и измельчают, Осадок в количестве 0,02 кг раст-20 воряют в 1 л воды с добавлением уксусной кислоты до рН = 6,5, перемешивают и удаляют балластные вещества фильтрацией, Раствор стерильно фильтруют и разливают во флаконы по 10 Mr 25 вещества, лиофилизируют. Выход активного вещества из исходного сырья составляет 0,01 кг.

Биологическую активность вещества

1 выделенного из селезенки, оценивали по показателям иммунитета экспериментальных животных

Эксперименты проводили на 50-ти морских свинках, самцах весом 200250 г. Животные были разделены на 35

5 равных групп: контрольную и подопытные. Подопытным животным вводили по 0 l Mr (рекомендуемая для люден терапевтическая доза) активных веществ, выделенных из селезенки раз- 40 личными способами, растворенных в

0,5 мл физиологического раствора.

Вещества вводили ежедневно внутримышечно в течение 20 дней. Контрольным животным по аналогичной схеме 4> вводили по 0,5 мл физиологического раствора. На 21-е сутки всех. животных забивали, выделяли селезенку и лимфатические узлы. Ткань селезенки и лимфатических узлов гомогениэи- 50 ровали, выделяли клетки и затем определяли удельную концентрацию лимфоцнтов (удельная концентрация - количество. клеток в тысячах на 1 мг ткани) и "активных" Т-лимфоцнтов ме- 55 тодом спонтанного роэеткообразования с эритроцитами кролика. Известно, что лимфоциты и "активные" Т -лимфоДля получения вещества предложенным спосббом имеется в достаточном количестве сырье.

Известно, что в селезенке присутствуют лимфоциты (антителообразующие клетки), которые осуществляют выработку антител на различные антигены.

Однако выработка антител лимфоцитами селезенки на ряд антигенов недостаточна. Поэтому применение вещества увеличивающего количество клеток в селезенке, позволяет увеличить образование и выход антител.

Проведены эксперименты, подтверждающие высокую эффективность препарата в отношении стимуляции антител

1158201 ество селе1 мг

Контроль (физраствор) 50

57+-5,7

120++1193

70 8,7

По авт. св. И 839090

По авт. св, Ф 111934

75+6,2

65 -5,6

"1 Статистически достоверно по сравнению с контролем (Р(0,05) Составитель П,Вонарцев

Редактор В.Ковтун Техред С.Легеза

Корректор О.Билак

Заказ 3427/8 Тираж 722 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 на тимусзавискмые антигены, Опыты проведены на 250 мьппах-самцах, линии СВА, весом 18-20 г, которые были разделены на 5 групп. Мьппам вводи. лк тимусзависимый антиген (эритроцк- 3 ты барана) в дозе 1 10 клеток в мл и через сутки 3 раза ежедневно подкожно вводили вещество иэ селезенки по О,! мг на мышь, а также вещества аналогов к прототипа. Затем через 7 дней мышей забивали, брали кровь и определяли общепринятым мето. дом титр антител и количество антителообразующих клеток в селезенке.

11

Результаты опыта представлены в таблице, По предложенному способу 50

"Ио патенту ФРГ В Р5 2157077 50

Из таблицы следует,что испольэова. ние вещества из селезенки позволяет значительно (статистически достоверно) увеличить количество антителообразующих клеток и образование и выход антител.

Эти результаты могут быть использованы для повышения выхода антител

1 у животных - продуцентов антител при получении лечебных антисывороток, что даст большой экономический эффект. Это вещество также можно будет использовать и для введения больным с целью стимуляции образования антител при введении различных вакцин, к которым антитела образуются в недостаточном количестве.

165 "21

453+39

247 31

237 29

193+27