Диагностикум для количественного определения стероидного гормона в биологических жидкостях организма человека

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ .РЕСПУБЛИК (19) (11) ГОСУД А (21) 2629447/28-! 4 (22) 21.06 ° 78 (31) 72775/77 (32) 21.06.77 (33) !Р (46) 23.02.86. Бюл. У 7 (71) Моринага Милк Индастри Ко.

Лтд (!Р) (72) Кацухиро Огаса, Морио Кубояма, Минору Санто, Цутому Кудо, Есицугу

Харада, Акис Кавасири и Еидзи Такахаси (!Р) (53) Ь 616-07 (088. 8) (56) Заявка Японии Ф 48-49918 (открытая патентная публикация), сер. 2(4), сб. К 20(34), 1973.

Заявка Японии N - 50-123819 (открытая патентная публикация), сер. 2(4), сб. Р 42(143), 1975. (54) (57) ДИАГНОСТИКУМ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕРОИДНОГО ГОРМОНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА, содержащий латексные (5!) 4 А 6 1 К 4 7 / 00 А 6 1 В 1 0 / 00 частицы и конъюгат сывороточного альбумина с гормоном, о т л и ч а— ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности целевого продукта, в качестве сывороточного альбумина он содержит альбумин быка, лошади, овцы, кролика или человека, в качестве гормона он содержит эстроген, прогестерон, андроген, !7-оксикортикостерон или их метаболиты, в качестве латексных частиц он содержит частицы полистирола или сополимера стирол-бутадиена раэмером

О, 234-0, 72 1 мкм при следующем количественном соотношении ингредиентов, мг:

Латексные частицы 100

Конъюгат сывороточного альбумина с гормоном 1,8-7,2 при этом в конъюгате на 1 моль сывороточного альбумина приходится 0,57 моль гормона.

4 12

Изобретение относится к медицине„ в частности иммунологии.

Цель изобретения — повышение чувствительности целевого продукта.

Пример 1. В качестве.стерои= да могут быть использованы следующие вещества: фолликулярный гормон (эстроген) гормон желтого тела (прогес1 терон), мужской половой гормон (17кетостероид), адренокортикальный гормон (17-гидроксикортикостероид) и стероид, который может представлять собой большое число метаболистов перечисленных стероидных гормонов.

Из сывороточных альбуминов могут быть использованы любые очищенные сыворотачные альбумины — бычий сывароточный 8Jrr J H (В S А), конский альбумин (E S А), овечий сывароточный альбумин (S S А), кроличий сыво--роточный альбумин (RSA), сывороточный альбумин человека (ПБА).

Среди этих веществ наиболее предпочтительными являются BSA u RSA.

Из числа латексных частиц могут быть использованы полистирольные латексные частицы, полибутадиенавые латексные частицы, стирал-бутадиеновые сопалимерные латексные частицы.

Размер частиц может лежать в диапазоне 0,234-0,721 мкм.

10 моль стерсид-глюкуронида, стероид-полусукцината или стероид10"карбоксиметилсксима на 1 моль сывароточного альбумина Растворяют в диметилформамнде. К этому раствору добавляют такое же количество молей

ТрН-í-бутиламина, что и стероидного

rîðèàHà, в качестве вспомогательного активатора, и смесь перемешивают.

К полученному раствору дс бавляют такое же количес"во малей изобутилхлорформиата, что и стероиднаго гормона, в качестве активатора, и смесь перемешивают.

Полученный раствор обозначают как жид кос т ь А.

Получение жидкости В.

Сывороточный альбумин растворяют в деионизированной воде. Доводят РН н.раствором Na0H до 8,0- t0,0. К полученным нескольким порциям раствора добавляют различные количества диметилформамида и готовят 9 образцов жидкости В, в которых содержатся различные количества RSA. Количество диметилформамида, содержащегося в каждой из порций жидкости В, 5

16

24

Q c

) устанавливают таким образом, чтобы общее количество днметилформамида, содержащегося в яждкостях А и В, было равно количеству деионизированной воды в жидкости В.

Получение конъюгата.

Каждую из жидкостей А по каплям добавляют к каждой из жидкостей Б в течение полутора часов при перемешивании, в эти растворы добавляют 1 н. раствор

ЫаОН и рН устанавливают 8,0-10,0, после чего каждый из растворов дополнительно перемешивают в течение

3 ч и в результате получают 9 образцов эстриол-16 х -глюкуронидВБА-конъюгатных растворов, Каждый из этих растворов подвергают диализу против дистиллированной воды. В диалнзированные растворы добавляют ацетон в количестве, равном 2 ч ацетона. на 1 ч. раствора, и после перемешивания добавляют

1 н.раствор НС1 для осаждения конъюгата, Осажденный конъюгат в каждом из растворов отделяют центрифугированием в течение 5 мин при скорости вращения 10000 об/мин. К каждому из отделенных канъюгатов добавляют деионизированную воду и после установления рН равным 8,0 с помощью

1 н. ЯаОН, каждый из этих растворов диализируют против дистиллированной воды для удаления ацетона. В результате получают 9 видов коньюгатов, имеющих различные числа связывания стероида. Получение конъюгата проо водят при низкой температуре (6 С).

Сенснбилизация латексных частиц.

Суспенэню латексных частиц готовят промыванием и/или раэбавлением латексных частиц подходящим буферным раствором (pH 7,2-8,6) и стероид-сывораточный альбуминовый конъюгат добавляют в нужной концентрации в эту суспензию. Смесь выдерживают при 37 С в теченче 2 ч при перемешивании для получения суспенэии сенсибилчзированных латексных частиц.

Полученную суспенэию центрифугируют и осадок отделяют, затем промывают буферным раствором. Центрифугирование и промывание повторяют несколько раэ. Осадок повторно суспендируют в буферном растворе для получения суспензии латекснык частиц, сенсибилизированных конъюгатом.

Количество конъюгата, используемое для сенсибилизации латексных частиц, 1213975 составляет 1,8-7,2 мг на 100 мг латексных частиц, при этом количество конъюгата, используемое для сенсибилизации латексных частиц, зависит от размера частиц (для сенсибилизации частиц размером 0,234 мкм и

0,721 мкм используют соответственно

72 мг и 18 мг на 1 ч. латексных частиц).

Получение антител.

Получают стероид-сывороточный альбуминный конъюгат по реакции стерои% да в таком состоянии, которое он имеет в жидкой среде живого организма или в экскретированной жидкости, или стероида, обладающего иммунологической кросс-реакционноспособностью по отношению к сывороточному альбумину, и затем полуконъюгат вводят, например, путем инъекции млекопитающему, сыворотка которого от— личается от сыворотки, используемой для получения конъюгата. Получают сыворотку.

Пример 2. Жидкость А готовят растворением 50 мг эстриол-16- а-глюкуронида в 10 мл диметилформамида, при перемешивании добавляют 26 мл три-н-бутиламина и затем 14 мл изобутил хлорформиата.

2,33 г RSA растворяют в 6 мл деионизированной воды, содержащей

1,0 мл NaOH, после чего добавляют

50 мл диметилформамида. Получают жидкость В.

К жидкости В по каплям добавляют жидкость А и смесь перемешивают в течение 1 ч. Затем добавляют 1,0 мл

1 н.раствора NaOH и перемешивание продолжают еще в течение 3,5 ч.

После диализирования раствора деионизированной водой на 1 ч. раствора добавляют 2 ч. ацетона и гомогенный раствор НС1 для осаждения синтезированного эстриол-16 -глюкуронидRSA — конъюгата. Полученный осадок отделяют центрифугированием при скорости вращения 10000 об/мин в течение 5 мин.

К отделенному осадку добавляют деионизированную воду, устанавливают рН = 8 с помощью 1 н. раствора

NaOH и проводят диализ деионизиро— ванной водой для удаления ацетона.

Получают 1,78 г конъюгата (выход о

757) . Процесс проводят при 6 С.

Число связывания эстриол-16Ж-глюкуронида, измеренное методом УФ-абсорб5

10 !

55 ции и методом динитрофенилирования, равно 2,2 и 1,9 соответственно.

76 мг конъюгата растворяют в

400 мл 40 мИ вероналового буфера (содержащего 150 мМ NaC1, рН 7,8), добавляют 10 мл суспензии (концентрация 10X) полистирольных латексных частиц размером О, 234 мкм и полученную смесь выдерживают в течение о

2 ч при 37 С для сенсибилиэирования.

Сенсибилизированную латексную суспензию подвергают центрифугированию при скорости вращения 4000 об/мин в течение 20 мин, полученный осадок суспендируют в 200 мл вероналового буфера и дважды центрифугируют в тех же режимах. Полученный осадок повторно суспендируют в 50 мп буфера и затем добавляют азид натрия до концентрации О, !Х. Получают SO мп суспензии (плотность 2X).латексных частиц сенФ сибилизированных эстриол-16M-глюкуронид-RSA.

В результате смешивания на предметном стекле О, 1 ют полученной суспензии сенсибилизированных латексных частиц и О, 1 мл разбавленного раствора антиэстриол-16 -глюкуронид-BSA, (разбавляют до получения титра, равного 0,04 нмоль эстриол-1бк-глюкуронид-экв./мл) в течение 1-2 мин наблюдают агглютинацию. Однако в том случае, когда антитела разбавляют до получения титра, равного

О, 02 нмоль эстриол-16k.— глюкуронидэкв./мл, агглютинации не наблюдается и титр латексного реагента, полученный в этом примере определен как

О, 04 нмоль эстриол-16>-глюкуронидэкв./мл.

Пример 3. Используя дегидроэпиандростерон (ДНЕЛ) и BSA, получают 8 образцов конъюгатов, имеющих различные числа связывания стероидов, лежащие в интервале 0,5-18,3.

0,75 г ДНЕЛ и 0,69 г о-карбоксиметилгидроксиламингидрохлорида растворяют в 20 мл этилового спирта. Полученную смесь подщелачивают путем добавления 2 мл 6,4 М раствора сукцинат натрия. Раствор нагревают с обратным холодильником в течение

1 ч и добавляют Na,COÄ до конечной концентрации 57.

После промывания полученного раствора эфиром, водный слой подкис— ляют концентрированной НС1 и отделяют осадок, который перекристаллизовывают из этанола. Получают

12139

0,6 r ДНЕА-17-(О-карбоксиметил)оксима (ДНЕА-CMO) .

К 1 мп 10%-ной суспензии латексных частиц размером 0,721 мкм добав. ляют 4 мл 20 мМ фосфатного буферного раствора рН 7,2, содержащего 150 мМ

NaC1. После тщательного перемешивания раствор центрифугируют со скоростью 4000 об/мин в течение 20 мин.

Полученный осадок суспендируют в 10

5 мл того же буфера, суспенэию центрифугируют при тех же режимах и отделяют осадок.

Антисыворотку получают от кроликов, иммунизированных конъюгатом 15

ДНЕА-СМО-Е$А.

Конъюгат получают следующим образом.

Жидкость А получают добавлением

0,5 r ДНЕА-СМО в 100 мл диметилфор — 20 мамида, после чего при перемешивании добавляют 0,33 мл три-н-бутиламинаи О, 18мл иэобутилхлорформната.

18,0 г BSA добавляют к 600 мл,цеионизированной воды, после чего,цобавляют 500 мл диметилформамида, в результате чего получают жидкость В.

К этой жидкости по каплям добавляют предварительно полученную жидкость А н после перемешивания в те- 30 чение 1,5 ч рН смеси устанавливают равным 9,0 с помощью 1 н. раствора

Na0H и перемешивание продолжают в течение 3,5 ч. Полученный раствор диалиэуют водопроводной водой и затем на 1 ч. раствора добавляют 2 ч. ацетона. После этого в раствор добавляют гомогенно перемешанный 1 н. раствор НС1 для осаждения синтезированного канъюгата и полученный раст- ) вор подвергают центрифугированию со скоростью вращения 5000 об/мин в течение 20 мнн. К отделенному осадку добавляют деиониэированную воду и после установления рН раствора, рав- gg ным 8 с помощью 1 н. раствора Na0H, полученный раствор диалиэуют водопроводной водой для удаления ацетона.

Получают 13,0 г ДНЕА-СМО-BSA конъюгата (выход около 70%). Число свя- у зывания стероида (ДНЕА-СМО) такого конъюгата, измеренное методом динитрофенилирования, равно 4, 1.

68 мг полученного конъюгата растворяют в 100 мл 100 мМ глицинового буферного раствора (содержащего

130 мМ NaC1 и 0,17. аэида натрия, рН 8, 2) добавляют 10 мп суспензии

75 б (концентрация 10%) полистирольных латексных частиц, затеи полученную смесь диализуют буферным раствором при комнатной температуре в течение

5 дней для сенсибилизации. Полученную таким образом сенсибилизированную латексную суспенэию подвергают центрифугированию при скорости вращения 4000 об/мин в течение 20 мин и после суспендирования осадка в

200 мл указанного буферного раствора эту суспензию центрифугируют и промывают указанным буферным раствором нри тех же условиях. Осадок повторно суспендируют в 50 мл того же буфера. Получают 50 мл суспенэни (концентрация 2%) сенсибилизированных

ДНЕА-СМО-BSA латексных частиц.

В результате смешивания на предметном стекле 0,05 мл и О, 1 нмоль/мл

ДНЕА с 0,05 мл разбавленной антисыворотки и последующего добавления

О, 1 мл полученной суспензии сенсибилизированных латексных частиц даже после 10 мнн не наблюдают агглютинации. В том случае, когда 0,1 кп суспенэии сенсибилизированных латексных частиц добавляют к смеси, состоящей из 0,05 мп 0,02 нмоль/мл

ДНЕА и 0,05 мл укаэанной разбавленной антисыворотки в течение 2-3 мин наблюдают агглютинацию.Титр латексного реагента, полученного в этом примере, принят как О, 05 нмоль ДНЕА экв./мл.

Пример 4. Жидкость А готовят растворением 1, 1 г тестостерон17-глюкуронида в 200 мп диметилформамида, к полученному раствору при перемешивании последовательно добавляют 0,52 мп три-н-бутиламина и затем 0,28 мл иэобутилхлорформиата.

Жидкость В получают растворением

46,6 г RSA в 1,2 л деионизированной воды и после установления рН равным

9,0 с помощью 1 н. раствора NaOH добавляют 1,0 л диметилформамнда.

Аналогично примеру 3 получают около

39,0 г тестостерон-17 †глюкуронидRSA(T-17-G-RSA). Выход около 827.

Число связывания стероида Т-17-G в этом конъюгате, измеренное методом

УФ-абсорбции и методом динитрофенилирования, равно 2,3 и 2,1 соответственно.

Затем к 100 мл суспенэни (концентрация 10%) полистирольных латексных частиц, имеющих размер час1213975

35

7 тиц 0,721 мкм, добавляют 400 мп

20 мМ фосфорно-кислого буферного раствора, содержащего 150 мМ NaC1 (рН 7,2), после чего суспензию центрифугируют при скорости вращения

4000 оЬ/мин в течение 20 мин. Полученный таким образом осадок суспендируют в 500 мл буферного раствора и затем после центрифугирования этой суспензии отделяют осадок. К отделен- 10 ному осадку добавляют 500 мп буферного раствора, содержащего 180 мг ранее полученного конъюгата. После выдерживания полученной суспензии в течение 2 ч при 37 С ее центрифугируют, затем промывают дважды буферным раствором, процесс центрифугирования повторяют. Полученный осадок повторно суспендируют в 500мл буферного раствора и добавляют азид натрия до конечной концентрации

0,1Х. В результате получают 500 мл суспензии (концентрация 2%) латексных частиц, сенсибилизированных

Т-17-G-RSA. 25

Получают антитела Т-17-G-RSA u затем сыворотку разбавляют буферным раствором до получения титра, равноFo 0,05 нмоль Т-17-G экв./мп. На предметном стекле 0,1 мл разбавленной антисыворотки смешивают с О, 1 мл полученной суспензии латексных частиц и в течение 1-2 мин наблюдают агглютинацию. Однако, когда антитела разбавляют до получения титра, равного 0,02 нмоль Т-17-G -экв./мл в течение 5 мин агглютинации не наблюдается. Таким образом титр латексного реагента, полученный в этом примере, принят равным 0,05 нмоль

Т-17-G-зкв./мл.

Тем временем готовят жидкость В путем растворения 17,6 r HSA в 600 мп деионизированной воды и рН устанавливают равным 9,0 с помощью 1 н..раствора NaOH и добавляют 500 мл диметилформамида. Затем таким же способом, что и в примере 3, получают 13,6 г. гидрокортизон-21-полусукцинат-HSA (НС-21-HS-HSA), выход около 75%.

Число связывания стероида (НС-21-HS) в таком конъюгате, измеренное методом динитрофенилирования, дает значение, равное 3,0.

Затем 200 мл 40 мМ вероналового буферного раствора, содержащего

150 мМ NaC1 (рН 7,8), добавляют к

50 мп суспенэии (концентрация 10Х полистирольных латексных частиц), имеющей размер частиц 0,721 мкм, и полученную таким образом суспензию центрифугируют при скорости вращения

4000 об/мин в течение 20 мин. Отделенйый осадок суспендируют в 250 мл. буферного раствора и затем центрифугируют при указанных условиях и полученный осадок собирают. Затем к собранному осадку добавляют 250 мп буферного раствора, содержащего 88 мг ранее полученного конъюгата, и полученную суспензию выдерживают при

37 С в течение 2 ч, после чего ее центрифугируют для отделения осадка.

Полученный осадок повторно суспендируют в 250 мл буферного раствора и центрифугируют, все эти процессы повторяют еще раз. Полученный осадок повторно суспендируют в 250 мп буферного раствора и затем добавляют .азид натрия до конечной концентрации О, 1%.

Получают 250 мл суспензии (концентрация 2%) латексных частиц, сенсибилизированных НС-21-HS-HSA.

50

Пример 5 ° Жидкость А готовят добавлением некоторого количества молей натрий гидрокортизон21-полусукцината к такому же числу молей концентрированной соляной кислоты, после чего полученную смесь концентрируют и промывают водой.

Процессы концентрирования и промывки повторяют несколько раз и затем вещество полностью высушивают 0,5 r полученного сухого вещества растворяют в 100 мл диметилформамида,после чего при перемешивании последовательно добавляют 0,2б мл три-н° бутиламина и 0,.14 мл изобутилхлорФормиата.

Затем 0,05 мл 0,1 моль гидрокортизона смешивают с 0,05 мл разбавленных антител и разбавляют буферным раствором до получения титра, равного

О, 1 моль HC-21-Н$ экв./мл, на предметном стекле с этим раствором смешивают О, 1 мл ранее полученной суспензии сенсибилизированных частиц. Даже через 10 мин не наблюдают агглютинации. Однако, когда 0,05 мл

0,05 нмоль/мл гидрокортизона и

0,05 мп указанного разбавленного антитела смешивают друг с другом и затем на предметное стекло добавляют

0,1 мя указанной суспензии сенсиби1213975

Составитель Г,Смирнова

Редактор С.Патрушева Техред М,Гергель Корректор А. Зимокосов

Зака э 788/63 Тираж 659

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам иэобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Подпис но е

Филиал ППП "Патент", r.ужгород, ул.Проектная,4 лизированных латексных частиц агглю- тинацию наблюдают в течение 2-3 мин.

Титр латексного реагента в этом примере принят равным 0,05 нмоль

НС-21-HS — экв./мл.

Чувствительность к обнаружению для реагента, содержащего эстриол16а-глюкуронид, составляет 0,81, 5 нмоль/мп, чувствительность известного реагента 2,5 нмоль/мп.