Способ индуцирования диплоидного гиногенеза у пеляди

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (50 4 А 01 К 61/00.ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCH0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3806409/28-13 (22) 29. 10. 84 (46) 15.07.86. Бил. № 26 .(71) Научно-производственное объединение по промышленному и тепловодному рыбоводству (72) Л.А.Полякова, M.À.Àíäðèÿøåâà, Т.И.Кайданова и А.Б.Локшина (53) 639.3.03 (088.8) (56) Черфас Н.Б., Илясова В.А. Рекомендации по получению диплоидного гиногенетического потомства у карпа, M.: ВНИИПРХ, 1979, с.32.

Refstic Т. Induction of diploid

gynogenesis in Atlantic salmon and

rainbow trouf using irradiated sperm

and heat chock can. 1983 J.Joul, 61, № 11, р.2411.

Мантельман И.И., Кайданова Т.И.

Применение химического способа инактивации спермиев при получении гиногенетических личинок пеляди. Известия ГосНИОРХа, т.153, 1980, с.37-42.

„„SU„„1243657 А I (54) (57) 1. СПОСОБ „ИНДУЦИРОВАНИЯ ДИПЛОИДНОГО ГИНОГЕНЕЗА У ПЕЛЯДИ, включающий генетическую инактивацию спер. миев и шоковое температурное воздействие на осемененную икру, о т л. и— ч а ю шийся тем, что, с целью получения массовых количеств диплоидных гиногенетических личинок, шоковому температурному воздействию подвергают яйцеклетки, находящиеся на .стадии ранней анафазы — II npu этом яйцеклетки прогревают при 15 i7 С в течение 30-40 мин, начиная а с 18-22 мин после осеменения.

2.Способ по п.1, о т л и ч а ю шийся тем, что генетическую инактивацию спермы проводят радиационным облучением.

1 12436

Изобретение относится к рыбному хозяйству на внутренних водоемах, в частности к генетическим способам

4 селекции рыб, а именно к способу индуцированного диплоидного гиногенеза у пеляди.

Целью изобретения является получение массовых количеств диплоидных гиногенетических личинок пеляди.

Сущность способа состоит в том, 1О что спермии пеляди подвергают генетической инактивации Уф-облучением, осеменяют ими икру и последнюю на стадии ранней анафазы — II подвергают тепловому воздействию в течение 15

30-40 мин при 15 — 17 С, начиная с 1822 мин после осеменения °

Параметры теплового воздействия наиболее существенны для достижения эффекта, так как тепловое воздейст- 20 вие разрушает нити веретена деления, в результате чего хромосомы второго редукционного тельца втягиваются в цитоплазму яйца и происходит восстановление диплоидности за счет 25 объединения женского пронуклеуса со вторым редукционным тельцем. В связи с этим особенно важным в способе является определение момента начала теплового воздействия. 30

С целью получения массовых гиногенетических партий пеляди производят узконаправленное непродолжительное тепловое воздействие, которое захватывает только стадию анафазы—

II которая поступает при темпера туре воды 2-6 С через 18-22 мин после осеменения (табл.1).

Подтверждением правильности предлагаемых параметров являются результаты опытов, проведенных при запредельных режимах (табл,2), Из табл.2 видно, что более раннее начало шока (табл.2, опыты 1-5) или более позднее (табл.2 опыты 7-11) значительно ,снижает вход диплоидных гиногенетических личинок. Изменение температуры шока выше 15-17 С и удлинение или сокращение длительности шока хотя и приводят к значительному увеличению частоты диплоидизации (до 59,27) (табл.2, опыты 9-11), но резко снижают выживаемость икры в целом, что ведет к значительному сокращению числа гиногенетических диплоидов (до нескольких штук) уже на стадии пигментации глаз. Снижение температуры шока ниже оптимального значения так..

57 же приводит к уменьшению выхода гиногенетических диплоидных личинок.

Пример 1. Получили и перемешали сперму от 10 самцов пеляди в возрасте 3+. Из полученной смеси отобрали 5 капель, которые суспендировали в чашке Петри в 12 мл раствора Гольтфретера двойной концентрации. Для генетической инактивации ядер сперматозоидов использовали ультрафиолетовые лучи от ртутной лампы типа БУВ-30 с длиной волны

257 мм. Лампа была откалибрована в институте Цитологии АН СССР. Для облучения чашку Петри со спермой помещали под лампу на магнитную мешалку. Расстояние от лампы до поверхности раствора спермы было 45 см. При токе 0,4А в этом случае мощность до-, мВТ зы 12,9, . Экспозиция облучения см2

2 мин ° Доза облучения за две минуты составляла 15,0 мДж/см . Энергия дозы сохранялась на расстоянии +15 см от осей лампы. Подвижность спермы опрецеляли до и после облучения при активации их водой. Для чего в каплю воды.на предметном стекле, помещенном на предметном столике микроскопа., вносили спермиев препаровальной иглой, при этом наблюдали их активные "вихревые" движения. После облучения, как правило, подвижность спермиев несколько снижалась.

Икру получили от одной самки пеляди в возрасте 3+. Взяли в контроль и в опыт по 7 5 тыс. шт. икринок, осеменили облученной спермой обычным сухим методом. Контрольную икру не подвергали температурным воздействиям, ее развитие происходило при температуре воды 1 — 6 С. Опытную икру через 20 мин после осеменения поместили в воду с температурой 16 С на 40 мин. Для того, чтобы температура шока была постоянной, миску с опытной икрой поместили в термостатированную водяную баню. Температуру во время опыта контролировали при помощи термометра с точностью до

0 1 C. После окончания срока теплового воздействия теплую воду слили, залили икру водой оптимальной для пеляди температуры 5 С и инкубировали в стандартных условиях в аппаратах Вейса. Наблюдения за развитием эмбрионов вели в течение всего инкубационного периода вплоть до вылупления личинок. з 1

Число гиногенетических диплоидов высчитывали в процентах от количества приступивших к развитию эмбрионов и определяли на двух. эмбриональных стадиях и на стадии личинок.

Частоту диплоидизации определяли на стадии бластулы средних клеток (4 сут эмбрионального развития), для чего икру фиксировали в уксуснокислом спирте (3:1). В контроле и опыте было исследовано по 50 эмбрионов. Окраску хромосом и приготовление дав1 леных препаратов проводили по общепринятой методике. На препаратах каждый эмбрион располагали и исследовали отдельно. Определяли плоид:ность и процент клеток с аберрантными митозами. На стадии пигментации ,глаз проводились отбор и подсчет гиногенетических диплоидов, диплои ды отбирали по признакам размера и степени окраски глаз. На стадии личинок . подсчитывали число вылупившихся нор243657 4 менения поместили в воду с темпера(У турой 17 С. Длительность прогрева

40 мин. В результате частота диплотизации 11,ОХ, количество гиногене5 тических диплоидов на 100-е сутки эмбрионального развития в контроле

1,2Х, а в опыте 5,2Х. Число гиногенетических личинок возросло от 0,08Х в контроле до 3,4Х опыте.

Согласно предлагаемому способу возможно получение массовых гиногенетических партий нормально развивающихся диплоидных гиногенетических потомков.,пеляди, которые являются ценным селекционным и экспериментальным материалом.

Способ может найти применение при получении второго и последующих гиногенетических поколений пеляди, кроме того, при воспроизводстве гибрида пелчира "в себе" и получении триплоидных особей пеляди.

Получение диплоидных гиногенетических личинок пеляди в массовых количествах позволяет внедрить метод индуцированного диплоидного гиногенеза в практику селекционных работ с пелядью и ускорить в 2-3 раза процесс селекции. Использование этого эффективного генетического метода при разведении пеляди дает возможность проводить промышленные скрещивания гиногенетических линий и получать гетерозисный эффект при товарном выращивании пеляди в прудовых и озерных хозяйствах северозапада.

Таблица

45 Время,,: мин

Стадии развития

20-40

60 мальных диплоидных гиногенетических личинок. В результате теплового шока частота диплоидизации повысилась от 3,4Х в контроле до 6,0Х в опыте, количество гиногенетических диплоидов на 100-е сутки увеличилось от 0,1Х в котроле до 10,6Х в опыте, а число нормальных диплоидных гиногенетических личинок возросло от

О,ОЗХ в контроле до 6,4Х в опыте.

Таким образом, использование приведенных в этом примере параметров температурных воздействий позволило получить наилучшие результаты.

П.р и м е р 2. Получили и перемешали икру от 11 самок. Использовали в контроле 6,0 тыс. шт. икри.нок, в опыте 270,0 тыс.шт. Сперму получили от 10 самцов. Экспозиция облучения 12 мин. Доза УФ-облучения спермы 90,0 мДж/см . Опытную партию .икры через 18 мин после осеменения прогревали 30 мин при 15 С, в результате чего частота диплоидизации повысилась от 3,2Х в контроле до

35,7Х в опыте. Количество гиногенетических диплоидов на 100-е сутки ! эмбрионального развития в опыте состав ляло 6,7Х, а число гиногенетических личинок 3,5Х.

Пример 3. Получили икру от

2 самок:и сперму от 7 самцов. В конт. роле и в опыте использовали по

7,5 тыс. икринок. Экспозиция облуче- ния 12 мин. Доза облучения 90 мДж/см

Опытную икру через 22 мин после осе-

Скорость прохождения второго мейотического деления в осемененной яйцеклетке паляди при температуре воды (+2)-(+6) С, Метафаза второго мейотического деления

Ранняя анафаза второго .мейотического деления

Ю

Поздняя анафаза второго мейотического деления

1243657

Продолжение табл.1

Продолжение табл,1

120-160

Погружение женского и мужского пронуклеусов вглубь цитоплазмы

Сближение и контакт женского и мужского пронуклеусов

Ранняя теплофаза второго мейотического деления

100

Отделение второго редукционного тельца

Появление сияния около мужского пронуклеуса

180-210

Таблица 2

Результаты зкспериментальных исследований .по разработке технологии получения массовых гиногенетических партий у пеляди путем дозированных тепловых шоков на определенной стадии развития яйцеклетки

Количест- Момент

Способ

Опыт, Р

Частота

Количество гиногенетических во исдиплоидизации, 7. пользованной диплоид ных лидиплои

ДОВ HR

95-100 икры, тыс ° шт ° чинок

7. после осемесутки, 7 нения, мин

1,2 0,08

7,5

0,3

7,5

9,7

2,2

0,01

10,7 0,2

12,1 1,9

9,7

0,2

0,9

Предлагаемый (с тем.. пературными воз действиями) 0,4

0,8

2,5

108, 1

40

7,5

30

59,2 3,8

25-22

26 или 15

Предлага- 6 емый (с темпера,турными 7 воздействиями) 12,5 1,3

40

7,7

Контроль (баз температурных воз действий) начала темпера турного воздействия

Длительность. воздействия, мин

Температура воздействия,"С

12,5 1,9 0,1

31,1 7,7

1243657

Продолжение табл.2

ТемпераЧастота диплои

Количество исОпыт, М

Момент начала

Количество гиногенетических

Способ дизации, 7 пользованной ствия, мин диплоид ных ли икры, тыс. шт. чинок, Ж после осемесутки, 7. нения, мин

3,3 0,4

19,0 0,2 t5,5 0,2

75

В связи с невозможностью проинкубировать до вылупления небольшие количества икры, которые оставались в некоторых опытах к концу инкубации, живые икринки (50-200 шт) иэ разных опытных вариантов объединяли для завершения инкубации в один аппарат, поэтому данные по выходу личинок в этих вариантах опытов отсутствуют.

Составитель О.Якименко

Редактор Т. Парфенова Техред Л.Олейник Корректор М.Пожо

Заказ 3729/1

Тираж 679 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5.Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная,4

9 7,5

10 7,5

11 7,5 темпера турного воздействия

Длительность воздейтура воздействия, С

15-18

18-17

18-17 дипло дов н

95-10