Способ получения @ -2-амино-4-метилфосфиномасляной кислоты

 

СОЮЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (5 4 С 12 P 13 4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н llATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3375844/28-13 (22) 21. 12. 81 (31) P 30 48 612. 5 (32) 23. 12.80 (33) DE (46) 23. 07. 86. Бюл, N - 27 (71) Хехст АГ (ЭЕ) (72) Сузанне Граблей и Клаус Заубер (DE) (53) 668.394(088.8) (56) Заявка ФРГ N - 2732301, кл. С 07 F 9/13, опублик. 1979.

Заявка ФРГ № 2939269, кл. С 07 Р 9/30, опублик. 1980.,(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 4-2-ANHHO

-4-ИЕТИЛФОСФИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ путем ферментативного гидролиза ацилазой в водной среде производного N-ацил-D, -2-амино-4-метил-фосфиномасляной кислоты с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения выхода изомера Ь-фосфинотрицина, в качестве производного используют

N-арилацетильное производное общей формулы

il

СН -Р— СН 2 — CHZ — CH — N H — СΠ— СН; -AP

" 0H СООН где Ar — фенил, а из ацилаз используют пенициллин-G-ацилазу, выделенную из Escherichia

coli ANCC 11105.

124689

Изобретение относится к производству аминокислот, а имейно к способу получения L-2-амино-4-метилфосфиномасляной кислоты ферментативным путем.

Целью изобретения является повышение выхода изомера L-фосфинотрицина.

Способ осуществляется следующим образом.

Готовят водный раствор N-арилацетильного производного общей формулы

О

11

CH — Р-СН вЂ” СН2-СН-ЬН-СО-СН -ЛГ

1

OH СООН где Аг — фенил, и осуществляют ферментативньгл гидролиз ацилазой, в качестве, которой используют пенициллин-С-ацилазу, выделенную из Escherichia coli ЛМСС 11105.

Затем после окончания процесса из образовавшейся смеси, состоящей из

L-2-амино-4-метилфосфиномасляной кислоты (L-ФТЦ), N-фенилацетил-D-2-ами но-4-метил-фосфиномасляной кислоты (N- фенилацетил-D-ФТЦ) и фенилуксусной кислоты, можно выделить L-ФТЦ, отличающуюся высокой степенью чистоты.

Пример 1. Берут 10 г (33,4 ммоль) N — фенилацетил — D L — ФТЦ и суспендируют в небольшом количестве дважды дистиллированной воды. Затем доводят рН суспензии путем добавления

Ц н. раствора гидроокиси натрия до 7, 8, после чего добавляют дистиллированную воду до получения 500 мл раст- 35 вора. с

В него вносят 15 мг пенициллин — С-ацилазы в виде лиофилизата, выделенной из Escherichia coli ANCC 11105, и полученную. реакционную смесь выдер- 40 живают 15 ч при комнатной температуре, после чего отбирают пробу и устанавливают путем окрашивания ее нингидрином содержание свободной аминокислоты. В данном случае степень 45 превращения составляет около 50%. Затем с помощью концентрированной соляной кислоты доводят рН смеси до 2,0 в .

3,0, фильтруют и полученный прозрачный раствор субстрата пропускают че- 50 рез колонку, заполненную 150 r Dayenca (R) 50 И х 2 (Н -форма) .

После этого колонку промывают водой до выхода из нее нейтрального 5. и не содержащего ионов хлора элюата, а затем 0,8 н.раствором хлористого водорода в смеси с этиловым спиртом и водой из колонки вымывают свободную аминокислоту в виде гидрохлорида, Из упаренного элюата получают чистый гидрохлорид ФТЦ с т.пл ° 199-200 С. Выход составляет 3,3 г (15,2 ммоль) — 45,4g).

Из гидрохлорида путем обработки окисью пропилена получают свободную кристаллическую L-аминокислоту с т.пл. 217-219 С и удельным углом враЫ о щения ()р =.- +28

Пр имер 2. Берут 60 г (200,5 ммоль) N-фенилацетил- D,L-ФТЦ и смешивают с небольшим количествам воды. Затем раствором гидроокиси натрия доводят рН суспензии до 8,0. После этого добавляют воду до объема суспензии, равного 1,0 л, и смешивают- с фиксированной пенициллин-G-ацилазой (активность примерно равна

80 l /г). Полученную реакционную смесь перемешивают 1,5 г, а затем отделяют фильтрацией нерастворимый в воде катализатор. Полученный фильтрат пропускают через колонку, заполненную 750 г сильно кислотной катионообменной смолы.

Дальнейшую обработку раствора ведут по примеру

В результате получают 20 r (92 ммоль .= 463) гидрохлорида 1.-ФТЦ о с т.пл. 199-201 С, удельным углом

22 -o вращения () = 23,3 и молярным враг щением (р)„ = 50,7.

Полученная после обработки гидрохлорида окисью пропилена свободная

L-ФТЦ имеет т,пл. 216-217 С, удельный угол вращения (<) = +28 5 и молярное вращение р), = 51,6

Пример 3. С целью исследова-.

1 ния стабильности, связанной с носителем пенициллин-G-ацилазы, используемой в примере ?, по отношению к N-аенилацетил-D,L-ФТЦ,. 100 мг фиксированнвго фермента смешивают с 10 мл 5Е-ного водного раствора N-фенил-ацетил-D

L-ФТЦ (рН суспензии стабилизируют на уровне 7,8 путем добавления фосфатнвго буфера). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре, Через

24 ч раствор субстрата фильтруют, отделяют фермент и вновь смешивают с раствором субсграта.

Активность фермента измеряют по содержанию свободной ФТЦ через 45 мин и через 22,5 ч. путем окрашивания проб нингидрином.

Значительного уменьшения стабильнэсги, связанной с носителем пенициллин1246897

Составитель M,Aíäðååâà

Техред Г.Гербер Корректор Г.Решетник, Редактор А.Шандор

Заказ 4030/60 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г,Ужгород, ул.Проектная, 4

-G-амилаэы, не было обнаружено спустя

8 недель. В каждом случае через 45 мин с начала реакции гидролизовалось около 207, а спустя 22,5 ч около 50Х в расчете на примененную рацемическую смесь, Пример 4. Для получения фиксированной пенициллин-G-амилазы берут коллагеновые мембраны, их активируют 1О по методике Кулэ, а затем смачивают

2 мл раствора пенициллин-G-амилазы, содержащего О, 1 моль фосфата калия с рН 8,0, 0,25 моль ацетата натРиЯ, и

0,0247-ным раствором водного азида натрия. Мембраны в этой смеси выдерживают 4 ч при 4 С, а затем промывают

1 М раствором хлористого натрия и

50 ммоль калийфосфатного буфера (рН равна 7,0).

Полученный материал вводят в реак" цию описанным в примере 2 образом с

60 r N-фенацетил-D-Ь-ФТЦ. В результате получают L-ФТЦ с тем же уровнем оптической чистоты, что и гидрохлорид

L-ФТЦ по примеру 2.