Способ выделения ферментных препаратов из технического ферментного препарата -амилоризин п10х

 

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ИЗ ТЕХНИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА АМИЛОРИЗИН ПЮХ, предусматривакяций приготовление водного раствора исходного ферментного препарата , экстракцию и спиртовое осаждение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью расширения возможного спектра получения ферментных препаратов, повышения их выхода и активности, водный экстракт готовят при соотношешт ферментного препарата и воды, равном 1:32-33, а осаждение осуществляют последовательно спиртовым фракционированием, .причем конечные концентрации спирта при фракционировании соответственАо равны 25-30% для выделения протеазы, 4550% - аминоацилазы, 70-75% - амилазы , при этом полученные ферментные препараты подвергают сушке. 149 Од сд to Ф

СС1ОЭ COBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

5 16 А1 (1% (11) (504 С 128900

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н. А ВТОРСКОМ,Ф СЕМ4ДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ . (21) 3781845/28-13 (22) 25.06.84 (46) 23.10.86. Бюл. 9 39 (71) Армянский филиал Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института химических реактивов и особо чистых химических веществ АФ (72) М, М. Амирханян, М, Ф. Еданян, О, М, Амирханян, В.М. Степанов, К. А. Субботин, А. М. Миневич и А. И. Горячев (53) 577.15(088.8) (56) Степанов В, М. и др, Выделение и характеристика ацилазы L-аминокислот из Азр. oryzac. — Биохимия, 1983, 48, У 5, с, 370-379, Авторское свидетельство СССР

Ф 910603, кл. С 07 В 19/02, 1980. (54) (57) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ

ПРЕПАРАТОВ ИЗ ТЕХНИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА АМИЛОРИЗИН П! ОХ, предусматривающий приготовление водного раствора исходного ферментного препарата, экстракцию и спиртовое осаждение целевого продукта, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью расширения возможного спектра получения ферментных препаратов, повьппения их выхода и активности, водный экстракт готовят при соотношении ферментного препарата и воды, равном 1:32-33, а осаждение осуществляют последовательно спиртовым фракционированием, .при- Я чем конечные концентрации спирта при фракционировании соответственно равны 25-307 для выделения протеазы, 45- у

50X — аминоацилазы, 70-75X — амилазы, при этом полученные ферментные препараты подвергают сушке. ф °

Аминоацилазная активность препарата равна 390 ед/г. Выход продукта по активности составляет 95Х.

f 126521

Изобретение относится к микробио- . логии, а именно касается способа получения ферментных препаратов аминоацилазы, амилаз ипротеаз из микробиологического сырья — амилоризина 5

П! ОХ.

Цель изобретения — расширение возможного спектра получения ферментных препаратов, повышение их выхода и активности. 10

Способ заключается в последовательном выделении из технического ферментного препарата амилоризина

П1ОХ ферментных препаратов протеазы, аминоацилазы и амилазы путем постепенного повышения концентрации этанола или изопропилового спирта при фракционировании.

Способ осуществляется следующим образом. 2О

Пример 1, В двадцатилитро- вый стеклянный аппарат, снабженный змеевиком для охлаждения, рассолом, мешалкой, капельной воронкой и термометром помещают 3,5 л дистиллнро- 25 ванной воды, 120 r амилоризина Н1ОХ, суспендированного в 0,5 л дистиллирбванной воды, Экстракцию ферментов осуществляют при перемешивании при

-22 С и рН 7 0 в течение двух часов 30 (рН поддерживают добавлением 2 н, раствора едкого натра) . Затеи открывают рассол,, снижают температуру содержимого аппарата до -1 С и тонкой струей при О С и рН 7,0 прибавляют заранее охлажденный (-8 С) этанол до 25%-ного содержания, Выпавший осадок, представляющий собой препарат протеаз, отделяют центрифугированием на центрифуге К-70 при 3000 об/мин и температуре (-1) С в течение

30 мин, растворяют в минимальном объеме воды и сушат лиофильно, Протеазная активность ферментного препарата равна 29 ед/г, выход препарата по .активности составляет 47%, Супернатант переносят zz, аппарат и при еремешивании, температуре

-2 Си рН 7,0 тонкой струей прибавля". ют охлажденный (-10"C) зтанол до

50%-ного содержания последнего, Вы-павший осадок, представляющий собой ферментный препарат аминоацилазы, отделяют центрифугированием, сушат лис ильно

Супернатант пост:е выделения ферментных препаратов протеазы и аминоацилазы переносят в аппарат и в вышеуказанных условиях прибавляют охлажденный этанол до 70%"ного содержания. Выпавший осадок амилолитического препарата отделяют центрифугированием и сушат лиофильно, Амилолитическая активность препарата равна 5300 ед/г, Выход препарата по активности составляет 96Х.

Супернатант, представляющий собой

70Х-ный раствор этанола, содержащий низкомолекулярные белки, пептиды и аминокислоты подвергают перегонке в вакууме при 60 С, Этанол используют повторно для этой же цели, а водный раствор, содержащий вышеуказанные продукты, концентрируют до получения удельного вeca, равного 1,1, Получают 120 мл продукта с d=1,1, содержащего 36,5 г сухих веществ, из которых 50% составляют аминокислоты, среди которых имеются такие незаменимые аминокислоты, какими являют ся метионин„ валин, лейцин, триптофан, фенилаланин.

Пример 2. Процесс проводят (аналогично примеру 1,с той разницей, что в.качестве спирта используют изо" пропиловый спирт, а конечные концентрации спирта соответственно равны: 30% при выделении протеаз, 45%— аминоацилазы и 75% — амилаз. Получают ферментный препарат с протеолитической активностью 25 ед/г, выход по активности составляет 56%; аминоацилазы с активностью 293 ед/г выход по активности 92Х; амилазы с активностью 6500 ед/г выход по активности

87%. Количество сухого аминокислотного препарата составляет 23 r.

Пример 3. Процесс проводят аналогично примеру 1, с той разницей, что высушивание препаратов осуществляют этанолом, Для этого мокрые ферментные препараты из центрифужных стаканов переносят в гомогенизатор, добавляют охлажденный (-8 С) этанол из расчета

30 мл на 10 г препарата и гомогенйзируют в течение 5 мин, фильтруют на воронке Бюхнера и сушат на воздухе в течение 12 ч.

Активности ферментных препаратов составляют 26, 410, 6000 ед/г, а выход 52, 97, 94%, 1265216

Пример 4. Получение ферментных препаратов на опытных установках в производственных условиях. Экстракцию проводят водопроводной водой, осаждение осушествляют непрерывно при 5 о

7 С, препараты выделяют на сепараторе-кларификаторе при 4170 об/мин и после лиофильной сушки подвергают дроблению.

В экстрактор емкостью 700 л, снаб-10 женный механической мешалкой помещают 200 л водопроводной воды с темпе" ратурой 25 С. Суспендируют 11 кг амилбризина П10Х в 163 л воды и переносят в экстрактор. Соотношение фер- f5 ментного препарата и Ho@bi составляет

1:33.

Экстракцию,осуществляют при 25 С и рН 7,0 в течение двух часов (рН поддерживают прибавлением 2н. раст.- 20 вора едкого натра), Экстракт насосом перекачивают в напорный бак (Ф 1), емкостью 1 м снабженный змеевиком, линиями рассола и воздуха, Подают умеренный ток 25 воздуха и при перемешивании охлаждают содержимое бака до 3 С. Из напорного бака (У 1) экстракт поступает через ротаметр в смесительную колонну диаметром 70 мм, высотой 1000 мм.

В эту же колонну из напорного бака (Ф 2), емкостью 50 м, через холо.цильник и второй ротаметр поступает этиловый гидролизный спирт с температурок -10 С. В смесительной колонне

35 экстракт непрерывно смешивается с этанолом, при этом часть ферментов, присутствующих в экстракте, выпадает в осадок, Процентное соотношение этанола в водно-спиртовой смеси состав40 ляет 25-26Х. Осаждение происходит при -10 С, Суспензия ферментов в водно-спиртовой смеси из смесительной колонны непрерывно поступает на сепаратор-кларификатор, где при 4170 об/ 45

/мин отделяется от водно-спиртовой смеси, I

Осадок, представляющий собой ферментный препарат с протеазной активностью, выгружают из сепаратора-кларификатора на раскладочный стол, затем на кюветы. Кюветы с препаратом устанавливают в камере морозильного стола и эамораживают до -30 С, Замороженный препарат помещают на этажер-55 ку, которая устанавливается в котле сублимационной сушилки, и сушат в течении 14 ч до температуры продукта 20 С.

Сухой препарат протеаз выгружают

t из сублимационной сушилки подвергают дроблению на дробилке.

Протеолитическая активность ферментного препарата равна 27 ед/г, выход препарата по активности составляет 603.

Водно-спиртовой раствор экстракта после выделения протеаэы поступает в напорный бак (9 3), емкостью 2,7 мЗ снабженный змеевиком, линиями рассола и воздуха, где при умеренном перео мешивании воздухом охлаждается до 3 С.

Из напорного бака (Ф 3) водноспиртовая смесь через ротаметр поступает в смесительную колонну, где непрерывно смешивае-ся с охлажденным (-8 С) этанолом, Содержание этанола в смеси составляет 517, Осаждение происходит при -9 С. При этом часть ферментов, присутствующих в водно" спиртовом растворе, выпадает в осадок. Выделение осадка, представляющего собой ферментный препарат аминоацилазу, его высушивание и дробление осуществляют как описано выше.

Аминоацилаэная активность фермент" ного препарата равна 430 ед/г, выход по активности составляет 983.

Водно-спиртовой раствор после выделения ферментных препаратов протеазы аминоацилазы поступает в напорный бак (N 1), охлаждается до

-5 С. Далее поступает в смесительную колонну, где смешивается с э-.анолом. Содержание этанопа в смеси составляет 71Х. Осаждение происходит при -9 С. Суспензия ферментов в водно-спиртовой смеси поступает на сепаратор и сепарируется при 4170 об/мин, Осадок, представляюпр.й собой амилолитический ферментный препарат, выделяют, высушивают и дробят. Амилолитическая активность ферментного препарата амилоризина (амилаза) равна 4500 ед/г, выход по активности составляет 987, Зависимость количества перешедшего в раствор белка от соотношения амилоризина П10Х и воды представлена в табл. !.

Из табл. i видно, что соотношение амилоризина П10Х и воды, равное 1:.

:(32-33), является оптимальным и его выбор ограничен, с одной стороны, неполной экстракцией ферментов, т,е. неполным переходом белка в раствор при уменьшении количества воды (ког5 1265216 да соотношение равно 1:.10), с другой

i стороны, тем, что увеличение количества воды (когда соотношение равно 1:40) не приводит к заметным изменениям, т.е. полная экстракция

3 белка из водного раствора амилоризина П10Х происходит при заявленном соо тношении.

Из табл. 2 видно, что изменение концентрации этанола, как в сторону щ уменьшения нижнего предела (25X), так и в сторону увеличения верхнего предела (503), приводит к снижению выхода ферментного препарата, Пример

В табл. 2 дана зависимость выхода аминоацилазы от изменения концентрации этанола.

Таблица 1

Продолжение табл. 1

14,92

15,08

15,14

1:30

1:33

1". 40

Таблица 2

Выход аминоацилазной активности, X

HHTepHBJI ROB центрации этанола, 7.

20-50

30-50

25-45

25-55

25-50

79,3

91,8

86,7

88,4

25 4

98 5

1:20

Составитель И. Привалова

Техред П.Сердюкова. Корректор M.Самборская

Редактор Г. Волкова

Заказ 5627/19 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная, 4