Способ получения полии олигодезоксирибонуклеотидов

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИИ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ,. в том числе и радиоактивномеченных, путем ферментативного синтеза изСоответсвующих дезоксинуклеозид-5-трифосфатов в какодилатном буфере в присутст- ВИИ ионов двухвалентных металлов, фермента терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (ДНТФ-азы) из тимуса, инициатора и SH-реагентов при 35-37°С в течение 12-24 ч с последующей хроматографической очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и расширения ассортимента целевых . продуктов, используют ДНТФ-азу, иммобилизованную на сефарозе, активиро .ванной BrCN, в концентрации 39,0 41 ,0 мг/мл, а синтез ведут в На-какодилатном буфере, рН 7,0-7,5, в присутствии ионов Mg в случае синтеза (Л на основе пуринов и Со в случае С синтеза на основе пирймидинов. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что хроматографическую очистку продуктов проводят на биогеле А-1,5 т, а злюацию осуществля ют водой.

СООЭ COBETCHHX

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН 4 С 07 Н?1 04 ИЗЛИВ - "

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (46) 30.04.88. Бюл. У l6 (21) 3585056/23-04 (22) 28.04.83 (72) А.Г. Акишев, Л.С. Гордеева, С.Н. Загребельный, В.Л. Каминский, Г.E. Комор, Г.А. Кузьмичева, В.К.Старостина и Л.Ф. Чернышева (53) 547.963.32(088.8) (56) Bollum F.I. Iroeniger Е. Janeda И. Polydeoxyadenilic acid. Biochem. 51.1964, 835-859..

Hayes F.И. Mitchell V.Е., Ratliff R-Ь. Williams D,Ь. Incorporation

efficiency of small oiigo -5 -пис1еоtides initiators in the terminal

deoxyribonucleotide transferase геас"

tion. Biochem. 5. 1966, 3625-3629 °

ВоПиш F.I. Biosynthesis polydeoxynucleotides. Procedure in nucluc

acid research ed. Cantoni G.I . and

Davies D.R. New Iork, 1966, .577-583. (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛКИ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ . s том числе и радиоактивномеченных, путем фермеитативного синтеза иэ. соответсг вующих дезоксинуклеозид-5 -трифосфатов в какодилатном буфере в присутст-i вин ионов двухвалентных металлов, фермента терминальной деэоксинуклеатидилтрансферазы (ДНТФ-азы) из тимуса, инициатора и SH-реагентов при 35-37 С о в течение 12-24 ч с последующей хроматографической очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и расширения ассортимента целевых . продуктов, используют ДНТФ-аэу, иммобилизованную на сефарозе, активированной BrCN, в концентрации 39,0—

4 1,0 мг/кп, а синтез ведут в Ка-какодилатном буфере, рН 7,0-7,5, в присутствии ионов Mg + в случае синтеза на основе пуринов и Со в случае синтеза на основе пиримидинов.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что хроматографическую очистку продуктов проводят на биогеле А-1,5 т, а элюацию осуществля ют водой.

1. Получение поли

Пример (dА).

В реакционную смесь, содержащую

0,2 моль/л Na-какодилата, рН 7,2, 8 ммоль/zq ИяСХ, 1 ммоль/л d АХФ, 4,5 мкмоль/л олиго (dA). 6 и

1 ммоль/л 2-меркаптоэтанола в 20 ил, добавляют 2642 единиц активности

ДНТФ-азы (800, ? мг). Реакционную смесь перемешивают при 37 в течение

22 ч. Затеи отделяют фермент фильтрацией и промывают его на фильтре 5 -мл

1 И NaCl, а в объединенный фильтрат добавляют 1,6 мл О, 1 И ЗДТА. Суммар" ная оптическая плотность реакционной смеси до синтеза 321 о.е. (259 нм), после обработки-. 227о.е. (я 259 нм), за 321 о.е. (я 259 нм), после обработки - 227 о.е. (я 259 нм), Фильтрат упаривают до объема 3 мл при 37 С и хроматографируют на колон" ке 1,6х100 см с биогелем А-1,5 т, уравновешенным водой, прн 6 С - 8 С, е элюируя водой со скоростью 30-40 мл/ч.

Выделяют два пика: I (поли (dA) где и. 50-700) — 135 о.е. (%а с

°, 257 нм, весовая экстинация

16,3 о.е./мг при рН 7,0); ХХ (исходный мономер) " 80 о.е. (Я 259 нм).

П.р и и е р 2. Получение поли (dC).

Препарат поли (dC) получают по аналогичной методике, исходя иэ

3 ммоль/л d ЦТФ, 18 мкмоль/л олиго, (4С)у.j и 1 ммоль/л СоС1 (вместо

Изобретение относится к биохимии, а именно к усовершенствованному способу получения поли- и олигодезоксинуклеотидов путем ферментатнвного синтеза.

Получаемые препараты могут быть испОльзованы для работ в области молекулярной биологии, например, в качестве матриц и инициаторов в системах ДНК-полимеразы, РНК-полимераэы и обратной транскриптазы, а также в ра" ботах по генной инженерии, например при синтезе регуляторной части гена.

Кроме того, они могут быть использованы в качестве моделей природной

ДНК при изучении ее физико-химических свойств.

Цель изобретения — упрощение способа и расширение ассортимента целе" вых продуктов эа счет использования иммобилизованного фермента в опреде ленных параметрах.

Ю

t5

26

ЗО

5 2 хлористого магния). Н реакции применяют 2080 ед. активности иммобилизованной ЛНТФ-аэы (800 иг). Суммарная оптическая плотность реакционной смеси до синтеза 470 о.е; (3 272 нм), после обработки — 441 о.е. (A =

272 нм), При хроматографии выделяют два пика: I (поли (ИЦ)„, п " 50120) — 135 о.е. (h „кс=.274 нм, seсовая экстинация 17, 6 о.е. /мг при рН 7,0); II (исходный мономер)

239 о.е. (9 272 нм).

Пример 3. Получение поли (dT).

Препарат поли (dT) получают аналогично примеру 2, исходя из

3 ммоль/л d ТТФ, 9 мкмоль/л олиго (dT)zs т и используя 1680 ед. активности иммобилиэованной ДНТФ-азы (800 мг). Суммарная оптическая плотность реакционной смеси до реакции595 о.е. (4 267 нм), после обработки 4950 о.е. (9l = 267 нм), При хроматографии выделяют. I (поли (dT)„, и — 50-700) — 251 о.е. (9 цд« 264 нм, весовая экстинация 17,7 о.е./мг при, рН 7,0), II (исходный мономер)

172 о.е. (Ф = 267 нм) .

Пример 4. Получение поли (de) .

Препарат поли (dG) получают по методике примера 1, исходя из

0,5 ммоль/л d CTP, б мкмоль/л олиго (об), и используя 1600 ед. активности иммобилизованной ДНТФ-аэы (800 мг).

Суммарная оптическая плотность реакционной смеси до синтеза " 145 о.е. (h = 252 нм), после обработки — 125 о.е, (h - =252 нм) .

Перед гель-фильтрацией на биогеле А-1,5, ш проводят осаждение продукта спиртом, для этого в фильтрат добавляют ПаС1 до концентрации 0р5 И и осаждают полимер двумя объемами

96Х-ного этанола. Осадок удаляют центрифугированием в течение 40 мин при 11000 об/мин. Супернатант сливают, а осадок растворяют в 2 мл воды и хроматографируют как в примере 1. Получают два пика: I {поли (46)я, и

20-700) - 32 о.е. (%»« 253 нм весовая экстинация 12 о.е./мг при рН 7,0; ХХ (мономер) - 8 о.е. (h

252 нм).

Пр им е р 5 Получение d (6АТЦА)А, Олигоде9оксинуклеотид получают по методике примера 1 используя в качестве инициатора 50 мкмоль/л d з 1266165 4 (ЖТ6А) и 500 ед. активности иммоби- ле хроматографии выделяют: Т лизованной ДНТФ-азы (120 мг) . Суммар- d (GAATTG) G, — 37 о.е. (9 ная оптическая плотность реакционной = "52 нм), Т (исходной мономер) смеси до синтеза — 56 о.е. (Э =259 нм), 18 о.е. (h 252 нм) . после обработки 36 о.е.r (3 =259 нм). S П р и и е р 7. Получение радиоПри хроматографии выделяют: Т активномеченых полидеэоксинуклеоти(d/КАТЦА/A< ) — 19 о.е. (A 259 нм), дов.

И (исходный d (GATgA)) — 42 o.e. (>"- Препараты полидезоксинуклеотидов, - 259 нм). меченных тритием .поли (d/8 — H/A), П р и м е, р 6. Получение поли И/8 — H/G).äîëè (d/5- Н/С), а (МАТТС) а, поли id/èåòèë- Н/Т), получают анало" гично соответствующим нерадиоактивнйм

ПРепаРат олигодеэоксинУклеотида полидезоксинуклеотидам (примеры 1-4), получают аналогично методике приме- но в качестве субстратов используют ра 5, исходя из 1 ммоль/л d 97P, 5 d/8- H/ATP, d/8- Н/СТР, d/5- Н/СТР, 100 ммоль/л S (GAATTQ) и используя d/метил- Н/ТТР в смеси с аналогичны380 ед. активности иммобилизованной ми немеченными деэоксинуклеозид-5дНТФ-азы (260 мг) . Суммарная оптичес- трифосфатами с конечной молярной аккая плотность реакционной смеси до тивностью 1-4 кКи/моль. синтеза 96 о.е. (Ф 252 нм), после у0 Данные по изменению параметров обработки — 62 о.е. (% 252 нм) . Пос- :способа представлены в таблице.

/, Концентрация иммобилизованного фермента

Уменьшение кои" центрацин фермента (меньшее

40+1 мг/мл) Уменьшение выхода продукта на 25Х и более.

Непроизводительное увеличение расхода фермента в 1, 5-2 раза.

Увеличение концентрации фермента (большее

40+1 мг/мл) Буфер

Замена Na-какодилата на Х-какодилат

Уменьшение выхода продукта по использованию трифосфатав 2 раза

Уменьшение выхода продукта в 1,5 и более раза

РН Реакционной РН Q 7,0 смеси

РН) 7,5

Уменьшение стабильности фермента, в результате чего уменьшается число циклов его использования.

Ф

Продолжение таблицы

1266 f65 Ионы двухвалентных ме таллов

Замена Ng на

Со при синтезе на осHo9IB пурннов

Составитель В..Голова

Техред М,дидык . корректор С. Йекмар

W ° (° °

Тираж 348 Подписное

ВНИИПК Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113ОИв Иосква, И-ЗЗ, Рауиская наб., д. 4/5

Редактор Г. Бельская

Заказ 3379

Производственно-полиграфическое предприятие, г. УйгорОд, ул. Проектная, 4

Замена Со на

%4

Ng - при синтезе на основе пиримидинов

Уменыиение выхода целевого продукта в 3 раза при синтезе поли (dT) и в 4 раза при синтезе поли (dC) Уменьаейие выхода целевого продукта в 1 7 раза