Способ определения формиат-иона в водных растворах

 

Изобретение относится к биохимии , может быть использовано для анализа формиата в сложных биологических смесях. Цель изобретения увеличение чувствительности и упрощение способа путем исключения использования растворов формиатдегидрогена J ff . ЗЫ с различной активностью, заменой их НАД (никотинамидадениндинуклеотид )-зависимой формиатдегидрогеназой , иммобилизованной на нерастворимом неорганическом носителе. Для этого исследуемый раствор, содержащий формиат-ионы: НАД

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU„„1271873

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3807843/28-14 (22) 31.10.84 (46) 23.11.86. Бюл. № 43 (71) МГУ им. М. В, Ломоносова и Институт биохимии им. А. Н. Баха (72) В. И. Тишков и А, M. Егоров (53) 6616-07(088.8) (56) Патент США № 3838011, кл. 195 " 103.5, 1974.

Ж, Аналитической химии, 1978, т. 33, ¹ 2, с. 364 — 367. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОРМИАТ-ИОНА

К ВОДНЫХ РАСТВОРАХ (57) Изобретение относится к биохимии, может быть использовано для анализа формиата в сложных биологических смесях, Цель изобретения— увеличение чувствительности и упрощение способа путем исключения использования растворов формиатдегидрогена .ы. -

С51! 4 С 12 N !1/14 С 12 Q 1/32 зы с различной активностью, заменой их НАД (никотинамидадениндинуклеотид) -зависимой формиатдегидрогеназой, иммобилиэованной на нерастворимом неорганическом носителе. Для этого исследуемый раствор, содержащий формиат-ионы: НАД (! — 10 мМ) и стабилизатор активности формиатдегидрогеназы со скоростью 0 5-5 0 мл/мин через проточный реактор с вытеснением, заполненный иммобилизованной на неорганическом растворителе НАД-зависимой формиатде гидро геназой с суммарной активностью 0,075-2,2 мкмоль/мин.

Объем образца в 1,5-8 раз превышает объем реактора, На выходе из реактора регистрируют величину максимальной оптической плотности образующегося НАД и по калибровочному графику определяют концентрацию формиата. 1 ил.

1271873

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для анализа формиата в сложных биологических смесях, Цель изобретения — увеличение 5 чувствительности и упрощение способа эа счет устранения необходимости использования растворов формиатдегидрогеназы с различной активностью, путем их замены НАД-зависимой формиатдегидрогеназой, иммобилизованной на нерастворимом неорганическом носителе.

На чертеже изображены калибровочные кривые для определения формиа- !5 та при степенях конверсии субстрата

5Х (1) и 157 (2 и 3) (кривая 1 реактор 0,2 мл, активность формиатдегидрогеназы 0,080 мкмоль/мин, скорость прокачивания образца 0,5 MJI/ìHí, 20 объем образца 0,5 мл; кривая 2 — реактор 0,8 мл, активность фермен:та

2,2 мкмоль/мин, скорость подачи раствора 5 мл/мин, объем образца

1,2 мп; кривая 3 — реактор 0,6 мл, активность фермента 1,1 мкмоль/мин, скорость прокачивания 2,5 мл/мин, объем образца 0,9 мл; концентрация

HAg во всех экспериментах 1,25 мМ, 0,05 M фосфатный буфер, рН 7,0, 30

20 ОС) .

Способ осуществляется следующим образом, Исследуемый раствор, содержащий формиат-ионы, НАД (1-10 MN) и стабилизатор активности формиатдегидрогеназы, пропускают со скоростью 0,55,0 мл/мин через проточный реактор с вытеснением, заполненный НАД-зависимой форми.ьтдегидрогеназой„ иммобилизованной на нерастворимом неорганическом растворителе с суммарной активностью 0,075-2,2 мкмоль/мин, так, чтобы степень превращения субстрата составила 5-157 ° Для этого 4 объем образца в 1,5-8 раз превышает объем реактора. На выходе из реактора регистрируют величину максимальной оптической плотности образующегося НАД и по калибровочному графику определяют концентрацию формиата.

Пример 1. Проточной реактор с вытеснением объемом 0,2 мл содержит 80 мг иммобилизованной на аминированном силохроме или стекле формиатдегидрогеназы с суммарной активностью 0,075 мкмоль/мин при рН 7,0 и

20 С. К 0,3 мл раствора формиата натрия {1,5 объема реактора) в 0,05 M фосфатном буфере (рН 7,0) добавляют 25 мкл 25 мМ раствора НАД и пропускают через реактор со скоростью

0,5 мл/мин при 20 С, Оптическую плотность раствора на выходе из реактора измеряют при 340 нм в проточной кювете, Минимально определяемая концентрация формиата составляет 1,5

-5

° 10 N. Зависимость оптической плотности от концентрации формиата представлена на чертеже (кривая 1) .

Пример 2, Выполняют способ, как в примере 1, эа исключением того, что активность фермента составляет 2,2 мкмоль/мин, скорость подачи раствора 5 0 мл/мин, соотношение объемов образца и реактора 8:1 (4,8 и 0,6 мл соответственно). Зависимость оптической IIJIQTHocTH от кон центрации формиата представлена на чертеже (кривая 2), Минимально определяемая концентрация формиата равна 5.10 М.

Пример 3. Способ выполняют, как в примере I ° Объем реактора 0,6 мл„ активность фермента

1,1 мкмоль/мин, объем образца 1,2 мл (соотношение 2:1), скорость подачи раствора в реактор 2,5 мл/мин, Данные представлены на чертеже (кривая 3). Минимально определяемая концентрация формиата 5.10 М, формула изобретения

Способ определения формиат-иона в водных растворах путем ферментативного восстановления никотинамидадениндинуклеотида при помощи,НАДзависимой формиатдегидрогеназы с последующей регистрацией содержания восстановленного никотинамидадениндинуклеоrHpa, п т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью увеличения чувствительности и упрощения способа за счет устранения необходимости использования растворов формиатдегидрагеназы с различной активностью, анализируемый образец пропускают со скоростью 0,5-5,0 мл/мин через проточный реактор с вытеснением, заполненный иммобилизованной на нерастворимом неорганическом носителе

НАД-зависимой формиатдегидрогеназой при активности фермента 0,0752,2 мкмоль/мин и соотношении объемов образца и реактора (1,5-8):1,